[發明專利]建立實時熒光定量檢測PER2啟動子甲基化水平的方法

在審

• 申請號: 202110757522.6
• 申請日: 2021-07-05
• 公開（公告）號: CN113308522A
• 公開（公告）日: 2021-08-27
• 發明（設計）人: 孫成銘;楊新;姜慧慧;彭絨雪;孫茁凱;劉杰;杜江東;孫枝紅
• 申請（專利權）人: 孫成銘;楊新
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 溫州青科專利代理事務所(特殊普通合伙) 33390
• 代理人: 錢磊

1.一種建立實時熒光定量檢測PER2啟動子甲基化水平的方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1.選擇PER2啟動子CpG島區域：

1)根據基因數據庫查詢到PER2啟動子序列；

2)通過CpG島在線預測網站預測PER2啟動子序列所包含的GpG島富集區并確定目標序列；

S2.根據目標序列設計PER2啟動子甲基化檢測的引物和探針；

S3.根據重亞硫酸鹽對基因序列的轉化規律設計目標序列甲基化和非甲基化序列，并人工合成相應序列，以質粒形式保存；

S4.實時熒光定量PCR檢測PER2啟動子甲基化方法的建立及性能確認：篩選合適的引物，并選擇引物探針組合，以相應質粒為模板，對檢測方法的性能進行評價，從而確認建立的方法的檢測性能。

2.根據權利要求1所述的建立實時熒光定量檢測PER2啟動子甲基化水平的方法，其特征在于，S4中，對檢測方法的性能進行評價包括對檢測方法的靈敏度、特異度、準確度和擴增效率的各性能進行評價。

3.根據權利要求2所述的建立實時熒光定量檢測PER2啟動子甲基化水平的方法，其特征在于，S4中，對檢測方法的性能進行評價中，模擬參考物質的拷貝濃度計算方法如下：質粒DNA的濃度為20ng/uL。質粒濃度換算為拷貝數計算公式：拷貝數(拷貝/μL)＝(質粒濃度ng/μL×10^-9)×(6.02×10²³)/(質粒堿基數×660)，依此公式計算的到質?？截悢禐?×10⁹copies/uL；然后將質粒MSP-5進行連續10倍倍比稀釋至0.6copies/uL。

4.根據權利要求1所述的建立實時熒光定量檢測PER2啟動子甲基化水平的方法，其特征在于，S1中，查詢到PER2啟動子序列如SEQ ID NO：1。

5.根據權利要求1所述的建立實時熒光定量檢測PER2啟動子甲基化水平的方法，其特征在于，S1中，確定目標序列如SEQ ID NO：2。

6.根據權利要求1所述的建立實時熒光定量檢測PER2啟動子甲基化水平的方法，其特征在于，S3中，人工合成相應序列是分別設計該序列的甲基化和未甲基化后經亞硫酸氫化學修飾后的序列，分別作為陽性參考物質MSP-5和陰性參考物質MSP-6。

7.根據權利要求6所述的建立實時熒光定量檢測PER2啟動子甲基化水平的方法，其特征在于，S3中，將MSP-5與MSP-6分別與pUC57載體連接，然后轉化至大腸埃希菌Top10感受態細胞，37℃振蕩培養1h，涂布于Amp+瓊脂平板上，篩選陽性克隆并擴大培養，分別用甲基化引物和非甲基化引物對MSP-5和MSP-6進行菌液PCR鑒定，甲基化引物序列如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4，非甲基化引物序列如SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6。

8.根據權利要求7所述的建立實時熒光定量檢測PER2啟動子甲基化水平的方法，其特征在于，S3中，MSP-5序列如SEQ ID NO：7，MSP-6序列如SEQ ID NO：8。

9.根據權利要求8所述的建立實時熒光定量檢測PER2啟動子甲基化水平的方法，其特征在于，MSP-5與pUC57載體連接后的序列如SEQ ID NO：9，MSP-6分別與pUC57載體連接后的序列如SEQ ID NO：10。

10.根據權利要求1所述的建立實時熒光定量檢測PER2啟動子甲基化水平的方法，其特征在于，S4中，引物為一對引物，序列如SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12，探針為一條探針，序列為SEQ ID NO：13。