[發(fā)明專利]一種CRISPR-SaCas9基因編輯系統(tǒng)及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110756753.5
• 申請日: 2021-07-05
• 公開（公告）號: CN113549650B
• 公開（公告）日: 2023-05-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張孝兵;程濤;張健萍;楊智學(xué);傅雅文
• 申請（專利權(quán)）人: 天津協(xié)和生物科技開發(fā)有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/90;C12N15/62;C12N5/10;A61K48/00;A61K38/46
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 劉二艷

本發(fā)明提供了一種CRISPR?SaCas9基因編輯系統(tǒng)及其應(yīng)用。所述基因編輯系統(tǒng)包括SaCas9載體、sgRNA載體和同源重組模板pDonor載體。本發(fā)明通過選擇合適的SaCas9載體的核定位信號、sgRNA載體的骨架結(jié)構(gòu)以及sgRNA載體的靶序列長度等多種手段，提高了mNeonGreen在人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞中EEF1A1位點(diǎn)和GAPDH位點(diǎn)的基因敲入效率。同時，本發(fā)明還系統(tǒng)比較了不同sgRNA長度的SpCas9和SaCas9針對同一位點(diǎn)的打靶效率和脫靶效率，最終得知本發(fā)明提供的CRISPR?SaCas9基因編輯系統(tǒng)是一種打靶效率高、脫靶效率低的新型基因編輯載體系統(tǒng)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基因編輯系統(tǒng)及其應(yīng)用，尤其涉及一種CRISPR-SaCas9基因編輯系統(tǒng)及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

CRISPR-Cas9是目前應(yīng)用最為廣泛的基因編輯工具。目前常用的CRISPR-Cas9基因編輯工具主要由兩部分組成，即負(fù)責(zé)切割雙鏈DNA的Cas9蛋白和負(fù)責(zé)通過堿基互補(bǔ)配對的方式識別目標(biāo)DNA區(qū)域sgRNA。

CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)的工作原理如下：

Cas9蛋白首先和sgRNA形成RNP復(fù)合物，Cas9-sgRNA復(fù)合物尋找基因組上的PAM序列(Protospacer?Adjacent?Motif，原間隔區(qū)相鄰基序)，并在PAM序列處識別和短暫停留。一旦sgRNA上的靶序列能夠與基因組上的序列完全互補(bǔ)配對，Cas9蛋白會對PAM序列前第3和第4個堿基間進(jìn)行切割造成DNA雙鏈斷裂(DSB)。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)無外源同源重組模板的情況下，細(xì)胞通過非同源末端鏈接(NHEJ)的方式對DSB進(jìn)行修復(fù)，這種修復(fù)是不精確的，容易造成單個或多個堿基的插入或者缺失形成Indel。如果有同源重組模板，細(xì)胞將通過同源重組(HDR)精確修復(fù)DSB，進(jìn)而可以將外源基因?qū)肽繕?biāo)區(qū)域，或者實(shí)現(xiàn)單堿基的替換等。

目前，常用的SpCas9蛋白來自化膿性鏈球菌(Streptococcus?pyogenes)，由1368個氨基酸組成(約4.1kb)，因其體積較大限制了其在基因治療領(lǐng)域中的應(yīng)用。SaCas9來自金黃色葡萄球菌(Staphylococcus?aureus)的Cas9，由1053個氨基酸組成(約3.3kb)，因其較小的體量和更低的脫靶效率，被廣泛應(yīng)用于體內(nèi)基因編輯實(shí)驗(yàn)。編碼SaCas9的基因比SpCas9小約1kb，這使得SaCas9能夠更有效的組裝進(jìn)入容量較小的AAV等病毒載體中并且高效表達(dá)，同時為其他調(diào)節(jié)元件和sgRNA等留下更多的空間，為將SaCas9和sgRNA包裝在同一AAV載體中提供可能。SaCas9的PAM識別序列為NNGRRT(R代表A或G堿基)，而SpCas9的PAM識別序列為NGG。SaCas9的PAM識別序列(NNGRRT)較長，大大增加了識別的特異性，降低了脫靶率。

綜上所述，SaCas9具有較小的體積和較低的脫靶效率，在基因治療領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。然而和常用的SpCas9相比，SaCas9的基因編輯效率較低。因此，進(jìn)一步優(yōu)化SaCas9基因編輯工具，提高其體內(nèi)外基因編輯效率具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種CRISPR-SaCas9基因編輯系統(tǒng)及其應(yīng)用。所述CRISPR-SaCas9基因編輯系統(tǒng)選用的核定位信號、sgRNA骨架以及sgRNA的長度，能夠顯著提高基因敲入效率。為達(dá)此目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

第一方面，本發(fā)明提供一種CRISPR-SaCas9基因編輯系統(tǒng)，所述CRISPR-SaCas9基因編輯系統(tǒng)包括：SaCas9載體、sgRNA載體和同源重組模板pDonor載體；

其中，所述SaCas9載體包括啟動子、SaCas9編碼基因、核定位信號、Wpre和PolyA，所述核定位信號包含編碼如SEQ?ID?NO.1～7中任意一項(xiàng)或至少兩項(xiàng)所示的氨基酸序列的核苷酸。