[發明專利]一種檢測爆炸物的光合細菌及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 202110755122.1
• 申請日: 2021-07-05
• 公開（公告）號: CN113373102B
• 公開（公告）日: 2022-09-09
• 發明（設計）人: 楊建明;梁波;張鑫平;湯若昊;王兆寶;李美潔
• 申請（專利權）人: 青島農業大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/31;C12N15/65;C07K14/21;G01N21/64;C12R1/38
• 代理公司: 青島合創知識產權代理事務所(普通合伙) 37264
• 代理人: 王曉曉

本發明提供了一種檢測爆炸物的光合細菌及其制備方法和應用。所述光合細菌的制備方法簡單，將沼澤紅假單胞菌中引入外源報告基因，利用菌株體內原有的生物感應元件識別爆炸物分子，通過報告基因表達產物產生信號來實現爆炸物分子的檢測。所述光合細菌最終被用來制備沼澤紅假單胞菌生物傳感器，其含有啟動子基因和轉錄調控蛋白基因、綠色熒光蛋白基因或熒光素酶基因。所述沼澤紅假單胞菌生物傳感器的檢測范圍寬、靈敏度高、方法簡便、成本低、安全性強、環境友好且適應性強，具有廣泛的應用前景。

技術領域

本發明屬于基因工程和分子生物學技術領域，具體涉及一種檢測爆炸物的光合細菌及其制備方法和應用。

背景技術

傳統的地雷等爆炸物檢測方法主要有生物探測、金屬探測、電磁感應探測、x-射線/中子背散射、聲波探測、雷達探測等，這些傳統的探測手段具有一定的局限性，如生物探測主要基于動物對于氣味的感官反應，由于動物思想不可控制，探測具有很大的不確定性；金屬、聲波和雷達探測主要基于探測者的主觀判斷，而電磁感應探測、x-射線/中子背散射雖然探測方法靈敏度較高，但需要有笨重的儀器設備，具有較高的假陽性，并且大多數情況下需要身赴雷區進行現場檢測（Onsite detection），具有很大的危險性，并且無法針對目前出現的陶瓷、塑料等新型材質的地雷進行探測。

檢測爆炸物的生物感應技術主要由感應元件和報告元件構成。其中感應元件可以感應被檢測物質，最常見的是細胞對靶標物質感應的啟動子區域或調控蛋白；報告元件可以將感應信號放大至可被計量的程度，常用的有可產生顏色、熒光或生物發光信號的lacZ,gfp, 和lux基因。生物感應技術的優點是：使用方便、簡單、可實現雷區外檢測（Standoffdetection），更加安全。該方法顛覆了傳統檢測技術，規避了地雷等爆炸物材質的問題，而且利用微生物進行群體檢測可有效地避免個體主觀差異對探測爆炸物的影響，提高檢測的客觀準確性，可與傳統的爆炸物檢測方法互為補充，提高爆炸物檢測的準確性和安全性。大腸桿菌作為研究生命科學的外源基因表達宿主，具有生長速度快、發酵周期短、遺傳背景清楚、易于工程化操作等特點，因此使用大腸桿菌對于特定化合物的檢測具有更簡便、更快捷的優點。

以色列科學家Shimshon Belkin報道了對爆炸物分子2,4-DNT的感應元件，即yqjF啟動子，利用GFP基因作為報告元件，構建了檢測2,4-DNT的生物感應系統，檢測限達到0.01mg/L（New Biotechnology, 2020, 59, 65-73）。除利用大腸桿菌作為生物傳感器的宿主細胞外，研究人員還開發了基于釀酒酵母（Nat. Chem. Biol., 2007. 3(6), 325-330）和微藻（Biosens. Bioelectron., 2004. 19(10), 1319-1323）的2,4-DNT檢測系統。雖然利用生物感應技術檢測地雷已取得一定進展，但檢測限的單位仍為微克/升級，然而揮發氣體中2,4-DNT的濃度僅為納克/升級，因此亟需提高靈敏度以滿足實際檢測的需求。另外，大腸桿菌、釀酒酵母和藻菌在自然界環境中不易存活，尤其是大腸桿菌是一種致病菌，在環境中大量投放這些種類的微生物會對生態環境帶來很大的影響，因此亟需開發環境友好型微生物作為生物傳感器的宿主菌。

發明內容

本發明提供了一種檢測爆炸物的光合細菌及其制備方法和應用。所述的光合細菌具有很好的檢測待測樣品中爆炸物分子的作用，且效果明顯。

為實現上述發明目的，本發明采用以下技術方案予以實現：

本發明提供了一種檢測爆炸物的光合細菌的制備方法，所述制備方法包括以下步驟：

（1）根據沼澤紅假單胞菌的轉錄調控蛋白的氨基酸序列獲得其編碼的核苷酸序列，再查找其上游啟動該編碼核苷酸序列的啟動子的核苷酸序列；

（2）將所述啟動子的核苷酸序列與熒光報告基因分別經純化、回收、酶切后相互連接，并轉化沼澤紅假單胞菌，鑒定陽性后得到工程菌株；