[發明專利]一種鑒定橄欖油摻雜的檢測方法

在審

• 申請號: 202110751993.6
• 申請日: 2021-07-02
• 公開（公告）號: CN113667724A
• 公開（公告）日: 2021-11-19
• 發明（設計）人: 李健
• 申請（專利權）人: 集美大學
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851
• 代理公司: 廈門創象知識產權代理有限公司 35232
• 代理人: 王鳳玲;尤懷成

1.一種鑒定橄欖油摻雜的檢測方法，其特征在于：包括以下步驟：

步驟一、引物設計：針對NCBI庫中棕櫚脂肪酸合成的基因設計并篩選：

針對橄欖油，篩選出第一引物對GL1及第二引物對GL2，所述第一引物對GL1包括上游引物GL1F及下游引物GL1R，所述第二引物對GL2包括上游引物GL2F及下游引物GL2R，所述GL1F、GL1R、GL2F、GL2R的核苷酸堿基序列分別如序列表SEQ ID NO:1至SEQ ID NO:4所示；

針對目標檢測物，篩選出第一引物對EO1及第二引物對EO2,所述第一引物對EO1及第二引物對EO2根據實際目標檢測物的NCBI庫中棕櫚脂肪酸合成的基因設計并篩選得到；

作為實時熒光定量PCR的內參，采用引物對TY2，所述引物對TY2包括上游引物TY2F及下游引物TY2R，所述TY2F及所述TY2R的核苷酸堿基序列分別如序列表SEQ ID NO:5及SEQ IDNO:6所示；

步驟二、待檢測橄欖油的DNA提取：采用質粒抽提試劑盒提取，得到待檢測DNA油樣；

步驟三、實時熒光定量PCR反應：在所述待檢測DNA油樣中加入引物對GL1、GL2、EO1、EO2及TY2進行擴增，以在40個循環內是否讀取到Ct值為標準，判斷是否得到陽性擴增，據此判斷橄欖油是否摻雜。

2.如權利要求1所述的一種鑒定橄欖油摻雜的檢測方法，其特征在于：所述步驟一中，所述目標檢測物為棕櫚油，所述第一引物對EO1包括上游引物EO1F及下游引物EO1R，所述第二引物對EO2包括上游引物EO2F及EO2R，所述EO1F、所述EO1R、所述EO2F及所述EO2R的核苷酸堿基序列分別如序列表SEQ ID NO:7至SEQ ID NO:10所示。

3.如權利要求1所述的一種鑒定橄欖油摻雜的檢測方法，其特征在于：所述步驟二的具體步驟為，取兩支50ml的試管，每管各加入懸浮液6.5ml和裂解液6.5ml，并加入待檢測樣品至50ml，顛倒混勻震蕩10min，10000r/min離心2min，去油相，在水相中加入橄欖油至50ml，重復上述動作4次；在兩支試管中第4次離心后保留的水相中加入13ml試劑盒中的結合液隨即上下顛倒6次，10000r/min離心20min，然后按照試劑盒后續操作說明進行，合并兩支試管的DNA油樣，制得待檢測DNA油樣，最后將待檢測DNA油樣存于-20℃中。

4.如權利要求1所述的一種鑒定橄欖油摻雜的檢測方法，其特征在于：所述步驟二的質粒抽提試劑盒采用上海碧云天生物技術有限公司生產的質粒抽提試劑盒D0026。

5.如權利要求1所述的一種鑒定橄欖油摻雜的檢測方法，其特征在于：所述實時熒光定量PCR的擴增參數如下：擴增反應體積為20ul，ROX I 0.25ul，2X Syker Mix 10ul，濃度為10umol/L的引物0.4ul，ddH₂O 7.35ul，DNA模板2.0ul；擴增反應條件：95℃5min，95℃5s，60℃31s，循環數40。

6.如權利要求1所述的一種鑒定橄欖油摻雜的檢測方法，其特征在于：還包括實時熒光定量PCR標準曲線的繪制：即采用已知拷貝數的橄欖油及目標檢測物作為標準樣品；擴增后，測定各油樣中相關熒光標記物的Ct值，該Ct值與拷貝數的自然對數呈線性關系，據此繪制SYBR Green I實時熒光定量PCR標準曲線。