[發明專利]一種從固氮藍藻中分離純化高純度藻膽蛋白的方法及藻膽蛋白

在審

• 申請號: 202110747801.4
• 申請日: 2021-07-02
• 公開（公告）號: CN113292648A
• 公開（公告）日: 2021-08-24
• 發明（設計）人: 季亮;范建華;陳成;鄭伊奕
• 申請（專利權）人: 華東理工大學
• 主分類號: C07K14/795
• 分類號: C07K14/795;C07K14/195;C07K1/14;C07K1/16;C12N1/20;C12R1/01
• 代理公司: 上海華工專利事務所(普通合伙) 31104
• 代理人: 繆利明;趙孟琴

本發明公開了一種從固氮藍藻中分離純化高純度藻膽蛋白的方法，包括：取一株固氮藍藻，接種于BG11培養基中，光照培養，離心收集藻液，二次離心，去上清，獲得藻體；然后將藻體重懸于PBS緩沖液中，獲得PBS藻體重懸液；接著，反復凍融PBS藻體重懸液，離心，獲得藻膽蛋白粗提液；接著，將藻膽蛋白粗提液加入到雙水相體系中，初步純化獲得藻膽蛋白提取液；接著，采用羥基磷灰石柱，采取不同離子梯度進行等度洗脫藻膽蛋白提取液，然后經透析除鹽獲得微藻藻膽蛋白。本發明還公開了采用上述方法制備獲得藻膽蛋白。本發明采用不同濃度等離子強度洗脫工藝，可同時實現高純度藻紅蛋白和藻藍蛋白的分離純化，原料利用率高。

技術領域

本發明屬于生化分離技術領域，具體地涉及一種從固氮藍藻中分離純化高純度藻膽蛋白的方法及藻膽蛋白。

背景技術

藻類是一類能進行光合作用的微生物，屬于原生生物的一種，可分為單細胞微藻和巨藻。藻膽體或色素體主要存在于藍藻和紅藻中，是其主要的捕光天線復合物，藻膽體一般由多種藻膽蛋白和連接蛋白組成，藻膽蛋白則是由藻膽素或色基與相應的脫輔基蛋白通過硫醚鍵共價連接而成。不同藻膽蛋白的結構基本相似，脫輔基蛋白一般由α、β亞基組成，少數含有γ亞基，α、β亞基多形成三聚體或六聚體，γ亞基多存在于六聚體中起到穩定結構的作用。藻膽蛋白的熒光特性主要由脫輔基蛋白上結合的藻膽素種類、位置、數量決定。藻膽蛋白按照吸收光譜性質藻膽蛋白可分為藻藍蛋白(Phycocyanin，PC)、藻紅蛋白(Phycoerythrin，PE)和別藻藍蛋白(Allophycocyanin，APC)。一般而言，藻膽蛋白的光譜學純度(A_max/A₂₈₀)越高，售價越高，根據其純度可細分為食品級(A_max/A₂₈₀0.7)，藥品級(A_max/A₂₈₀3.0)和試劑級(A_max/A₂₈₀4.0)。藻膽蛋白具有抗氧化性、抗炎性、抗衰老性、抗癌性和免疫熒光性等功能，被廣泛用作天然色素(食品、護膚品、染料等)、醫藥保健品和分子生物學研究中的熒光試劑，潛在市場需求巨大。

固氮藍藻是一類低等原核植物。它能進行固氮作用，固定空氣中分子態氮成為氮素化合物；又能進行光合作用，將二氧化碳變為碳素化合物并放出氧氣，為自身的固氮提供能源和還原劑。其細胞中含有的葉綠素a能夠進行產氧型光合作用；其異形細胞(heterocyst)是進行固氮的場所；細胞能分泌胞外多糖(EPS)，EPS為多聚陰離子大分子，可與陽離子相互作用，它對Na⁺的吸附能影響外環境pH改變。

藻膽蛋白這類胞內活性物質的獲取主要分為提取和純化兩個過程。就提取而言，主要是通過物理方法處理達到細胞破碎的效果，離心收集細胞破碎液，即藻膽蛋白粗提液。目前常用的細胞破碎方法有浸提法、玻璃珠研磨法、液氮研磨法、勻漿機處理法、超聲破碎法。例如：發明專利CN 104292316 B中采取粉碎后浸提的方法提取龍須菜中的R-型藻紅蛋白，該方法耗時長，僅浸提這一步需要24-48h。中國專利申請CN109206504 A中采取混合研磨和超聲波破碎結合的方法提取螺旋藻中的藻藍蛋白，該提取方法復雜，鑒于超聲波破碎儀的局限性，該方法在高純度藻膽蛋白的大規模工業化生產上不可行。