[發明專利]一種高靈敏快速定量檢測環境樣品中新型氯霉素抗性基因的方法及其應用

在審

• 申請號: 202110743911.3
• 申請日: 2021-06-30
• 公開（公告）號: CN113481309A
• 公開（公告）日: 2021-10-08
• 發明（設計）人: 李炳;梁賀彬;張家禹
• 申請（專利權）人: 清華大學深圳國際研究生院
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6851
• 代理公司: 北京市誠輝律師事務所 11430
• 代理人: 李玉娜;范盈

本發明涉及環境和基因檢測技術領域，尤其是涉及一種高靈敏快速定量檢測環境樣品中新型氯霉素抗性基因的方法及其應用。方法包含環境樣品基因組DNA的提取；目的基因的特異性引物及其擴增；將目的基因片段與pEASY?T1載體連接轉化至感受態細胞中，挑選單克隆使用通用引物對M13F/M13R進行菌落PCR已驗證陽性克隆；陽性克隆的PCR產物進行膠回收純化后10倍梯度稀釋構建Q?PCR標準曲線；參照構建的標準曲線，對環境樣品中新型氯霉素抗性基因進行定量檢測。相比于現有技術，本發明只需要構建標準曲線，無需依賴數據庫的完整性，可以大幅度縮短檢測時間和成本，同時能對不可培養微生物以及不同環境中新型氯霉素抗性基因進行同步檢測，提高了鑒別的準確度。

技術領域

本發明涉及環境和基因檢測技術領域，尤其是涉及一種高靈敏快速定量檢測環境樣品中新型氯霉素抗性基因的方法及其應用。

背景技術

抗生素抗性基因(Antibiotic resistance genes,ARGs)是使細菌產生抗生素耐藥性的功能基因，可通過多種直接或間接的傳播轉移途徑在環境介質中廣泛傳播，同時在傳播過程中造成多種抗性菌甚至“超級細菌”的出現，進而加速抗生素抗性的傳播和增強，嚴重威脅人類健康和生態系統穩定。抗性基因污染已被聯合國衛生組織列為21世紀新型三大污染問題之一。因此，新型抗生素抗性基因的分析檢測，對環境中ARGs污染水平評估和削減治理具有重要的現實意義。

氯霉素曾被廣泛的應用于畜牧和水產養殖業的病害防治，但因其具有較強的毒副作用而逐漸被禁止在獸醫臨床和食品動物中的使用。有研究表明，環境中的氯霉素殘留對氯霉素抗性的產生具有顯著相關性，且ARGs可通過水平基因轉移的方式在不同細菌之間進行傳播，進而導致其在環境中的殘留更加持久。然而，在面對不同環境中的選擇壓力，比如多重抗生素脅迫，微生物可能會在現有的抗性基礎上衍生出一些新型抗性基因，以應對一種或者多種選擇壓力。目前現有的新型ARGs檢測技術主要是依賴于純培養技術和高通量測序技術等方式。雖然純培養技術能夠實現對新型ARGs的準確定性分析，但該方法驗證周期長，操作較為復雜，然而無法實現對不可培養微生物及環境樣品進行高通量檢測；高通量測序技術則依賴于現有數據庫的完整性，無法及時檢測新型抗性基因的賦存情況，并且檢測周期較長，價格昂貴。因此，需要開發一種簡便快速且靈敏度較高的方法來對不同環境樣品中新型氯霉素抗性基因進行快速檢測。

發明內容

為了解決上述背景技術中所提出的問題，本發明的目的在于提供一種高靈敏快速定量檢測環境樣品中新型氯霉素抗性基因的方法及其應用，該方法操作簡單易行，靈敏度較高，檢測周期短，且可同時對不同環境樣品中新型氯霉素抗性基因進行快速定量檢測。

為了達到上述目的，本發明所采用的技術方案為：一方面，本發明提供了一種高靈敏快速定量檢測環境樣品中新型氯霉素抗性基因的方法，包括以下步驟：

(1)環境樣品的預處理以及基因組DNA的提取；

(2)目的基因的擴增；

(3)標準質粒的構建；

(4)Q-PCR標準曲線的構建；

(5)環境樣品中新型氯霉素抗性基因的定量檢測。

進一步地，步驟(1)中所述環境樣品的預處理為：將采集得到的環境樣品經6000-8000rpm，4℃離心5-10分鐘，棄上清后收集沉淀，然后將沉淀放置-80℃保存。

進一步地，步驟(2)中所述目的基因的擴增具體為：根據新型氯霉素抗性基因的核酸序列，采用Primer Premier 5.0軟件設計特異性引物對；分別以環境樣品基因組DNA和ddH₂O為模板進行目的基因PCR擴增，PCR產物經1％瓊脂糖凝膠電泳檢測后使用膠回收試劑盒將目的基因片段純化回收和測序。