[發(fā)明專利]一種高靈敏快速定量檢測環(huán)境樣品中新型氯霉素抗性基因的方法及其應(yīng)用

在審

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• 申請日: 2021-06-30
• 公開（公告）號: CN113481309A
• 公開（公告）日: 2021-10-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李炳;梁賀彬;張家禹
• 申請（專利權(quán)）人: 清華大學(xué)深圳國際研究生院
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6851
• 代理公司: 北京市誠輝律師事務(wù)所 11430
• 代理人: 李玉娜;范盈

1.一種高靈敏快速定量檢測環(huán)境樣品中新型氯霉素抗性基因的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)環(huán)境樣品的預(yù)處理以及基因組DNA的提取；

(2)目的基因的擴(kuò)增；

(3)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建；

(4)Q-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建；

(5)環(huán)境樣品中新型氯霉素抗性基因的定量檢測。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高靈敏快速定量檢測環(huán)境樣品中新型氯霉素抗性基因的方法，其特征在于，步驟(1)中所述環(huán)境樣品的預(yù)處理為：將采集得到的環(huán)境樣品經(jīng)6000-8000rpm，4℃離心5-10分鐘，棄上清后收集沉淀，然后將沉淀放置-80℃保存。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的高靈敏快速定量檢測環(huán)境樣品中新型氯霉素抗性基因的方法，其特征在于，步驟(2)中所述目的基因的擴(kuò)增具體為：根據(jù)新型氯霉素抗性基因的核酸序列，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計特異性引物對；分別以環(huán)境樣品基因組DNA和ddH₂O為模板進(jìn)行目的基因PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳檢測后使用膠回收試劑盒將目的基因片段純化回收和測序。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的高靈敏快速定量檢測環(huán)境樣品中新型氯霉素抗性基因的方法，其特征在于，步驟(3)中所述標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建具體為：將步驟(2)中純化后的目的基因片段與載體連接，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞中，挑選單克隆使用通用引物對M13F/M13R進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證陽性克隆。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的高靈敏快速定量檢測環(huán)境樣品中新型氯霉素抗性基因的方法，其特征在于，步驟(4)中所述Q-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建具體為：將步驟(3)中陽性克隆的PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收純化，測定回收產(chǎn)物中DNA濃度，計算回收產(chǎn)物中DNA的拷貝數(shù)；隨后對回收產(chǎn)物中DNA進(jìn)行10倍梯度稀釋，分別將稀釋產(chǎn)物作為模板進(jìn)行Q-PCR，構(gòu)建相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的高靈敏快速定量檢測環(huán)境樣品中新型氯霉素抗性基因的方法，其特征在于，步驟(5)中所述環(huán)境樣品中新型氯霉素抗性基因的定量檢測具體為：將環(huán)境樣品的基因組DNA作為模板進(jìn)行Q-PCR，其與步驟(4)中Q-PCR技術(shù)的體系和程序相同；根據(jù)步驟(4)中構(gòu)建的Q-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，對環(huán)境樣品中新型氯霉素抗性基因的拷貝數(shù)進(jìn)行定量。