[發明專利]一種制備高品質人源牙髓干細胞的方法

在審

• 申請號: 202110740561.5
• 申請日: 2021-06-24
• 公開（公告）號: CN115521906A
• 公開（公告）日: 2022-12-27
• 發明（設計）人: 王英亞;劉冬羽;李治寰
• 申請（專利權）人: 東莞宣冠干細胞再生醫學有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;A01N1/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明涉及細胞生物領域，公開了一種于體外分離制備高品質人源牙髓干細胞的方法，包括以下步驟：S1.依據牙齒供者的年齡與健康情況進行樣本初篩，隨后采集牙齒并運送到GMP實驗室。S2.利用工具將牙齒壓碎，并取出已暴露的牙髓組織，將其進一步剪碎后，加入聯合消化酶，震蕩消化分解組織；終止消化反應后，離心獲取沉淀。S3.加入完全培養基將組織細胞重懸并且過濾，得到單細胞懸液。S4.將細胞接種于培養瓶中，每周進行2次換液，待瓶中細胞的融合度達到80～90％，加入胰酶替代物(Tryple?Express)消化細胞并進行傳代擴增。本發明通過對牙齒樣本的嚴格篩選和對牙髓干細胞分離培養方法的進一步規范調整，以確保一種高品質的臨床級牙髓干細胞的制備產出。

技術領域

本發明涉及細胞生物領域，尤其涉及一種在體外分離制備高品質人源牙髓干細胞的方法。

背景技術

干細胞是機體的起源細胞，是形成人體各種組織器官的始祖細胞。近20年，是干細胞治療應用蓬勃發展的時段；與之為基礎的，是細胞制備技術的飛速提升。間充質干細胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)作為干細胞的一個研究分支，不但具有干細胞的所有共性，即自我更新和多向分化能力，而且還擁有其他干細胞所沒有的優點，那就是向損傷組織定向遷移并能根據具體環境來調節免疫反應的能力；同時也因其來源廣泛且易于分離制備而成為了臨床應用最為廣泛的一類干細胞。研究者從最初的骨髓，到后來的脂肪、臍帶和胎盤等人體組織器官中均已發現并成功分離出了間充質干細胞。

在2000年，美國學者Gronthos等人首次發現并制備出了人源牙髓干細胞(Dentalpulp stem cells，DPSCs)，這是一類存在于人體牙髓組織中具有較強自我更新和多向分化潛能的未分化細胞或前體細胞，屬于間充質干細胞。相比其他組織來源的間充質干細胞，牙髓干細胞不但來源廣泛，無論是6～12歲幼兒自然脫落的乳牙還是19～30歲成人的智齒中都含有豐富的牙髓間充質干細胞；而且牙齒的采集過程安全方便且不涉及倫理學問題。此外，牙髓干細胞的免疫原性相對較低，并能在合適的體內或體外環境下分化為多種人體細胞；能為組織、器官修復和自體、異體移植的細胞治療等提供細胞來源，具有廣闊的應用前景。

目前有關干細胞的制備方法與培養體系雖多種多樣，但制備所得的牙髓干細胞其增殖能力與多向分化能力卻存在參差不齊的情況。一方面，對牙齒樣本的質量標準未有一個明確的篩選說明，以致經常發生因牙齒結構受損，最終影響牙髓干細胞培養的成功率，最壞的結果可能是提取不到牙髓組織或提取出來的牙髓組織無法培養出干細胞。另一方面，傳統的細胞培養體系中存在著由于培養周期過長而導致干細胞提前分化、原代細胞數量較少而必須進行多次傳代以及制備培養過程易受到微生物污染以致抗生素濫用等問題。這些細胞制備培養過程中的技術難點，最終會影響牙髓干細胞在臨床研究與治療上的應用效果。本發明的目的是提供一種牙髓干細胞的制備方法，該方法縮小了不同供體來源的牙髓干細胞的品質差異，提高了細胞的制備成功率與原代培養獲得率，保障了其臨床級別的大規模產出。

發明內容

為了克服上述現有技術的不足，本發明提供了如下技術方案：

一種制備高品質人源牙髓干細胞的方法，包括以下步驟：

S1，篩選適齡且健康的牙齒供者，由專業的醫護人員為供者進行牙齒檢查與拔牙手術；將采集的牙齒放于保存液中，于24小時內運送到GMP實驗室。

S2，利用臺虎鉗將牙齒的髓腔打開，取出牙髓，剪碎牙髓組織塊后，添加5倍組織塊體積量的聯合消化酶(中性蛋白酶、I型膠原酶和透明質酸酶)進行恒溫振蕩消化，隨后加入適量的完全培養基終止消化反應，離心去除上清液。

S3，加入完全培養基將組織塊與細胞進行重懸，采用孔徑為80～150μm的濾網對懸液進行過濾，獲得單細胞懸液。

S4，將步驟S3得到的牙髓細胞懸液接種于培養瓶中，每周進行2～3次換液，待瓶內細胞融合率達到80～90％后，加入胰酶替代物進行消化傳代培養。