[發明專利]一種制備高品質人源牙髓干細胞的方法

在審

• 申請號: 202110740561.5
• 申請日: 2021-06-24
• 公開（公告）號: CN115521906A
• 公開（公告）日: 2022-12-27
• 發明（設計）人: 王英亞;劉冬羽;李治寰
• 申請（專利權）人: 東莞宣冠干細胞再生醫學有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;A01N1/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種制備高品質人源牙髓干細胞的方法，其特征在于，包括以下關鍵步驟：

S1，篩選適齡且健康的牙齒供者，由專業的醫護人員為其進行牙齒檢查與拔牙手術，將采集的牙齒放于保存液中，于24小時內運送到GMP實驗室。

S2，利用臺虎鉗將牙齒的髓腔打開，取出牙髓，剪碎牙髓組織塊后，添加5倍組織塊體積量的聯合消化酶(中性蛋白酶、I型膠原酶及透明質酸酶)進行恒溫振蕩消化，隨后加入適量的完全培養基終止消化反應，離心去除上清液。

S3，加入完全培養基將組織塊與細胞進行重懸，采用孔徑為80～150μm的濾網對懸液進行過濾，獲得單細胞懸液。

S4，將步驟S2得到的牙髓細胞懸液接種于培養瓶中，每周進行2～3次換液，待瓶內細胞融合率達到80～90％后，加入胰酶替代物進行消化傳代培養。

2.根據權利要求1所述的制備高品質人源牙髓干細胞的方法，其特征在于，所述牙齒供者的年齡在6～30周歲之間(智齒：19～30周歲，乳牙：6～12周歲)。

3.根據權利要求1所述的制備高品質人源牙髓干細胞的方法，其特征在于，所述牙齒供者的健康情況，依據其近3個月的體檢信息及健康調查表，選擇無遺傳性或傳染性疾病的供者。

4.根據權利要求1所述的制備高品質人源牙髓干細胞的方法，其特征在于，所述步驟S1中，優選采集臨床定義的二級松動的乳牙和經專業資質醫生確認的無深齲、無充填與無修復體、無隱裂、牙髓腔無嚴重鈣化的智齒。

5.根據權利要求1所述的制備高品質人源牙髓干細胞的方法，其特征在于，所述步驟S1中，在征得知情同意后，從供者身上采集拔下的牙齒，并將其儲存在30mL的牙齒保存液中，4～8℃儲存運輸，盡快送達制備地點，24小時內最佳。

6.根據權利要求5所述的制備高品質人源牙髓干細胞的方法，其特征在于，所述牙齒保存液為含1％雙抗(100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素)的無菌生理鹽水。

7.根據權利要求1所述的制備高品質人源牙髓干細胞的方法，其特征在于，所述聯合消化酶中性蛋白酶、I型膠原酶和透明質酸酶的質量比為(2～5)∶(2～5)∶(0.1～0.3)。

8.根據權利要求1所述的制備高品質人源牙髓干細胞的方法，其特征在于，所述恒溫震蕩消化具體指組織塊在37℃的恒溫震蕩器中100～200rpm振蕩消化20～40min。

9.根據權利要求1所述的制備高品質人源牙髓干細胞的方法，其特征在于，所述濾網的孔徑優選為100μm。

10.根據權利要求1所述的制備高品質人源牙髓干細胞的方法，其特征在于，所述完全培養基包含5～10％人血小板裂解液、50mg/L L-抗壞血酸、1mg/L尼克酰胺、100ng/mL生物素、11mg/L脫氧胞苷鹽酸鹽、292mg/L L-谷氨酰胺和終濃度為1％青-鏈霉素雙抗的α-MEM培養基。

11.根據權利要求1所述的制備高品質人源牙髓干細胞的方法，其特征在于，所述步驟S4中，細胞的接種密度為1顆牙齒所得細胞接種1個T25細胞培養瓶，培養基體積為5～10mL。

12.根據權利要求1所述的制備高品質人源牙髓干細胞的方法，其特征在于，所述步驟S4中，換液培養基為含5％～15％的人血小板裂解液的α-MEM培養基。

13.根據權利要求1所述的制備高品質人源牙髓干細胞的方法，其特征在于，所述步驟S4中，待傳代細胞使用胰酶替代物進行消化，加入量為1～2mL每瓶T25，消化時間為2～3min。