[發(fā)明專利]一種用于同時檢測蝦急性肝胰腺壞死癥和肝腸孢子蟲的多重RPA引物和探針組合物及檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110732960.7
• 申請日: 2021-06-29
• 公開（公告）號: CN113234814B
• 公開（公告）日: 2023-08-22
• 發(fā)明（設計）人: 高嵩;馬超;廖磊;王佩;張雪;王昱
• 申請（專利權）人: 江蘇海洋大學
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/6893;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 南京專信知識產權代理有限公司 32605
• 代理人: 郝曉燕

本發(fā)明涉及生物檢測領域，特別涉及一種用于同時檢測蝦急性肝胰腺壞死癥和肝腸孢子蟲的多重RPA引物和探針組合物及檢測方法。本發(fā)明公開了一種用于同時檢測蝦急性肝胰腺壞死癥和肝腸孢子蟲的多重RPA引物和探針組合物，該組合物包括用于檢測蝦急性肝胰腺壞死癥的RPA引物和探針、用于檢測肝腸孢子蟲的RPA引物和探針，本發(fā)明所述的多重RPA引物和探針組合物特異性強，靈敏度高，檢測結果準確。本發(fā)明還公開了一種急性肝胰腺壞死癥和肝腸孢子蟲的同時檢測的方法，該方法成本低，不依賴復雜的儀器設備、反應快速靈敏，操作簡單。

技術領域

本發(fā)明涉及生物檢測領域，特別涉及一種用于同時檢測蝦急性肝胰腺壞死癥和肝腸孢子蟲的多重RPA引物和探針組合物及檢測方法。

背景技術

蝦是一種生活飲食中常見的水產品，在全球的需求量都是非常大的，然而微生物或病毒感染引起的蝦傳染病對蝦養(yǎng)殖業(yè)危害極大。在這些傳染病中，急性肝胰腺壞死綜合征(AHPND)?能夠在蝦生長至25天時開始發(fā)病，傳染快速，錯過早期治療可能造成100％的死亡率。肝腸孢子蟲(EHP)雖然并不致命，但是具有傳播快，臨床癥狀不明顯等特點，可以使得蝦產量大大下降，對養(yǎng)殖戶造成嚴重的經(jīng)濟損失。因此肝腸孢子蟲也是目前蝦養(yǎng)殖過程中需要時刻監(jiān)控的傳染病之一。目前為止，關于這兩種傳染病并沒有有效的治療方法，只能依靠早期診斷和傳統(tǒng)的流行病防控措施來避免經(jīng)濟損失，因此在養(yǎng)殖場實地快速，便攜地檢測對于監(jiān)控傳染病的發(fā)展非常重要。

目前關于這兩種傳染病的分子診斷方法有很多，例如Nested?PCR，qPCR等，這些方法雖然檢測靈敏，但是都存在著一定的缺點，例如設備依賴性強，檢測人員要求高，并不能滿足偏遠地區(qū)養(yǎng)殖場的檢測需求。而隨著檢測技術的不斷發(fā)展，等溫擴增的方法也開始出現(xiàn)，例如LAMP，然而它雖然是等溫擴增技術，但是它依舊需要一個相對精確的溫控設備來實現(xiàn)最佳的反應，這也使得它的發(fā)展在很多場所還是受到限制。

發(fā)明內容

本發(fā)明旨在提供一種用于同時檢測蝦急性肝胰腺壞死癥和肝腸孢子蟲的多重RPA引物和探針組合物，該組合物特異性強，靈敏度高，檢測結果準確。本發(fā)明還公開了一種急性肝胰腺壞死癥和肝腸孢子蟲的同時檢測的方法，該方法成本低，不依賴復雜的儀器設備、反應快速靈敏，操作簡單。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明具體采用如下技術方案：

一種用于同時檢測蝦急性肝胰腺壞死癥和肝腸孢子蟲的多重RPA引物和探針組合物，其特征在于，所述多重RPA引物和探針組合物包括用于檢測蝦急性肝胰腺壞死癥的RPA引物和探針、用于檢測肝腸孢子蟲的RPA引物和探針，其中：

所述用于檢測蝦急性肝胰腺壞死癥的RPA正向引物、反向引物和探針序列分別如SEQ?ID?NO.1、SEQ?ID?NO.2、SEQ?ID?NO.3；

所述用于檢測肝腸孢子蟲的RPA正向引物、反向引物和探針序列分別如SEQ?IDNO.4、?SEQ?ID?NO.5、SEQ?ID?NO.6。

優(yōu)選的，用于檢測蝦急性肝胰腺壞死癥的探針序列的5’端用FITC標記，3'端用C3-space?進行封閉，距離5'端的30堿基距離處用四氫呋喃取代原有堿基；

用于檢測肝腸孢子蟲的探針序列的5'端進行DIG標記，3'端用C3-space進行封閉，距離?5'端30堿基距離處用四氫呋喃取代原有堿基；

用于檢測蝦急性肝胰腺壞死癥和肝腸孢子蟲的反向引物進行Biotin的標記。

優(yōu)選的，所述多重RPA引物和探針組合物中檢測蝦急性肝胰腺壞死癥的RPA正向引物、反向引物和探針的摩爾比為1:1:0.3，所述用于檢測肝腸孢子蟲的RPA正向引物、反向引物和探針的摩爾比為1:1:0.3。