[發(fā)明專利]一種乳制品前處理方法及乳制品中唾液酸的檢測(cè)方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110731895.6
• 申請(qǐng)日: 2021-06-28
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN113567570A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-10-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 袁麗霞;王煜;陳祥松;吳金勇;姚建銘
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 合肥中科特一健康科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): G01N30/02
• 分類(lèi)號(hào): G01N30/02;G01N30/06;G01N30/74
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利商標(biāo)代理有限公司 44202
• 代理人: 顏希文

1.一種乳制品前處理方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)制備含有唾液酸的乳制品樣品溶液；

(2)取步驟(1)中制備得到的樣品溶液進(jìn)行超濾離心，取下層清液加入DMB試劑，熒光衍生后得到樣品溶液A；

(3)取步驟(1)中制備得到的樣品溶液加入三氯乙酸，冰水浴后出現(xiàn)蛋白沉淀，將出現(xiàn)蛋白沉淀的樣品溶液進(jìn)行超濾離心，得到蛋白沉淀；向蛋白沉淀中加入酸水解試劑，加熱水解后迅速冷卻，得到水解液A；取水解液A加入DMB試劑，熒光衍生后得到樣品溶液B；

(4)取步驟(3)中離心后的上清液，加入酸水解試劑，加熱水解后迅速冷卻，得到水解液B；取水解液B加入DMB試劑，熒光衍生后得到樣品溶液C；

(5)取步驟(1)中制備得到的樣品溶液，加入DMB試劑熒光衍生后，超濾離心得到樣品溶液D。

2.如權(quán)利要求1所述的乳制品前處理方法，其特征在于，所述步驟(1)中，乳制品樣品溶液的制備方法為：將不添加唾液酸的乳制品，加入唾液酸，噴干制成乳制品粉末；唾液酸的質(zhì)量百分含量為乳制品粉末的0.1-0.5％；乳制品粉末加水溶解，得到樣品溶液。

3.如權(quán)利要求1所述的乳制品前處理方法，其特征在于，所述步驟(2)中，超濾離心所用的超濾離心管的膜孔徑為2000-4000DA，超濾離心的溫度為3-5℃，超濾離心的離心力為3000-5000g，超濾離心的時(shí)間為10-20min；下層清液和DMB試劑的體積比為：下層清液：DMB試劑＝1：1-3。

4.如權(quán)利要求1所述的乳制品前處理方法，其特征在于，所述步驟(3)中，三氯乙酸在樣品溶液中的體積百分含量為15-25％；冰水浴的時(shí)間為10-15min；超濾離心所用的超濾離心管的膜孔徑為2000-4000DA，超濾離心的溫度為3-5℃，超濾離心的離心力為3000-5000g，超濾離心的時(shí)間為10-20min。

5.如權(quán)利要求1所述的乳制品前處理方法，其特征在于，所述步驟(3)中，蛋白沉淀和酸水解試劑的質(zhì)量體積比為：蛋白沉淀：酸水解試劑＝1：50-70；加熱水解的溫度為70-90℃，加熱水解的時(shí)間為1.5-3.5h；水解液A和DMB試劑的體積比為：水解液A：DMB試劑＝1:1。

6.如權(quán)利要求1所述的乳制品前處理方法，其特征在于，所述步驟(4)中，上清液和酸水解試劑的體積比為：上清液：酸水解試劑＝1:1；加熱水解的溫度為70-90℃，加熱水解的時(shí)間為1.5-3.5h；水解液B和DMB試劑的體積比為：水解液B：DMB試劑＝1:1。

7.如權(quán)利要求1所述的乳制品前處理方法，其特征在于，所述步驟(5)中，樣品溶液和DMB試劑的體積比為：樣品溶液：DMB試劑＝1:1。

8.如權(quán)利要求1所述的乳制品前處理方法，其特征在于，所述步驟(3)和步驟(4)中，酸水解試劑包含甲酸、乙酸、鹽酸、硫酸、硝酸中的至少一種，酸水解試劑的摩爾濃度為1-3M；所述步驟(2)、步驟(3)、步驟(4)、步驟(5)中，熒光衍生的溫度為70-90℃，熒光衍生的時(shí)間為40-60min。

9.一種乳制品中唾液酸的檢測(cè)方法，其特征在于，采用權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的乳制品前處理方法進(jìn)行前處理后，進(jìn)行檢測(cè)。

10.如權(quán)利要求9所述的乳制品中唾液酸的檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟：

(a)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；

(b)乳制品的前處理；

(c)色譜分離檢測(cè)條件及出峰時(shí)間；

流動(dòng)相：A：0.05％乙酸水，B：純甲醇，試劑為HPLC色譜純；洗脫方式為線性梯度洗脫：在2min內(nèi)甲醇由初始的35％降至20％，保持3.5min后再返回至初始的35％；進(jìn)樣量：10μl；流速：0.8-1.0mL/min，柱溫：25-30℃；檢測(cè)器為熒光檢測(cè)器，發(fā)射波長(zhǎng)448nm，激發(fā)波長(zhǎng)373nm，響應(yīng)時(shí)間1.5s，采樣頻率2HZ。