[發(fā)明專利]一種高品質(zhì)的青貯構(gòu)樹發(fā)酵方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110731318.7
• 申請日: 2021-06-30
• 公開（公告）號: CN113444663A
• 公開（公告）日: 2021-09-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳超;郝俊;張鳴珠;孫文濤;鄭玉龍
• 申請（專利權(quán)）人: 貴州大學(xué)
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;A23K30/18;A23K10/30;C12R1/01
• 代理公司: 重慶金橙專利代理事務(wù)所(普通合伙) 50273
• 代理人: 唐健玲

1.一種高品質(zhì)的青貯構(gòu)樹發(fā)酵方法，包括以下工作步驟：

步驟一：選定青貯原料，青貯原料為第三茬全株雜交構(gòu)樹，刈割高度離地15cm，自然風(fēng)干30min后，用鍘草機(jī)切碎為1.5-2.5cm小段進(jìn)行青貯封裝；

步驟二：設(shè)置對照組CK和對比組P97、P94和P91，其中P97內(nèi)部添加濃度為3％的玉米淀粉液，P94內(nèi)部添加濃度為6％的玉米淀粉液，P91內(nèi)部添加濃度為9％的玉米淀粉液；

步驟三：MRS培養(yǎng)基的準(zhǔn)備:

(A)將10g蛋白胨、5g牛肉粉、4g酵母粉、2g葡萄糖、1ml吐溫80、2g磷酸氫二鉀、5g乙酸鈉、2g檸檬酸三銨、0.2g硫酸鎂、0.05g硫酸錳、15g瓊脂粉加入無菌培養(yǎng)瓶中，隨后添加1000ml蒸餾水中混合均勻；

(B)對(A)中的混合液進(jìn)行加熱溶解；

(C)利用pH計(jì)對(B)中的混合液的酸堿值進(jìn)行檢測，并將pH調(diào)整至5.5-6.7；

(D)將調(diào)制好的MRS培養(yǎng)基，并予以編號1-30；

步驟四：菌種接種培養(yǎng)：

(一)將步驟一中切碎的構(gòu)樹樹葉和編號1-15的MRS培養(yǎng)基分別裝入PVC真空封口袋進(jìn)行分裝處理，隨后集中高溫滅菌15-20分鐘；

(二)將(一)中的分裝處理后的MRS培養(yǎng)基在實(shí)驗(yàn)室中避光儲存60天后開封。

步驟五：使用鈣圈溶法對菌種分離純化；

(A)將步驟二中發(fā)酵好的溶液稀釋；

(B)在稀釋后的溶液中添加10-12mlMRS培養(yǎng)基，凝固后注入4-5ml水瓊脂培養(yǎng)基，制成厭氧環(huán)境，在30℃-37℃中培養(yǎng)2-4天，出現(xiàn)出現(xiàn)針頭狀或圓形稍扁菌落，周圍形成透明圈；

(C)挑取培養(yǎng)基變黃、透明圈較大的菌落，反復(fù)劃線純化2-3次，并分裝予以編號；

(D)通過鏡檢，將乳酸菌中接種于編號16-30的MRS培養(yǎng)基中，25-36℃中培養(yǎng)1-3天；

(E)穿刺于編號16-30的MRS培養(yǎng)基中碳酸鈣半固體進(jìn)行篩選處理，25-36℃中培養(yǎng)1天；

步驟六：性能檢測，包含有發(fā)酵指標(biāo)測定、微生物多樣性測定、發(fā)酵品質(zhì)測定。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高品質(zhì)的青貯構(gòu)樹發(fā)酵方法，其特征在于：所述發(fā)酵指標(biāo)測定指標(biāo)包含有pH、乳酸、乙酸、丙酸、丁酸和氨態(tài)氮。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種高品質(zhì)的青貯構(gòu)樹發(fā)酵方法，其特征在于：所述pH的檢測通過使用pHS-3CpH儀，所述氨態(tài)氮的檢測通過使用苯酚-次氯酸鈉比色法進(jìn)行測定，所述乳酸、乙酸、丙酸和丁酸的測定采用高效液相色譜儀型號為Agilent1260，色譜柱型號Agilent5TC-C18(25×4.6mm)，流速0.8ml/min。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種高品質(zhì)的青貯構(gòu)樹發(fā)酵方法，其特征在于：所述微生物多樣性的分析基于PacBio平臺，采用SMRT方法對青貯飼料中微生物的基因進(jìn)行測序，之后通過CCS序列進(jìn)行過濾、聚類和去噪，并進(jìn)行物種注釋及豐度分析。