[發明專利]番茄花葉病毒的RT-RAA-LFS快速可視化檢測引物、探針和試劑盒及應用

在審

• 申請號: 202110726324.3
• 申請日: 2021-06-29
• 公開（公告）號: CN113430302A
• 公開（公告）日: 2021-09-24
• 發明（設計）人: 鄭紅英;來宇超;宋雪梅;曹宇浩;彭杰軍;魯宇文;陳劍平;燕飛
• 申請（專利權）人: 寧波大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12Q1/6804;C12N15/11;C12R1/94
• 代理公司: 寧波奧圣專利代理有限公司 33226
• 代理人: 何仲

本發明公開了番茄花葉病毒的RT?RAA?LFS快速可視化檢測引物、探針和試劑盒及應用，特點是包括根據番茄花葉病毒的運動蛋白和外殼蛋白區段設計特異性引物及熒光探針，引物序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示，其試劑盒包括反應體系如下：29.4μL A緩沖液，2.1μL 10μM的上游引物，3μL10μM的下游引物，0.6μL10μM的探針，1μL RNA植物汁液粗提液模板，11.4μL ddH₂O，2.5μL B緩沖液，總體積為50μL，優點是靈敏度高、特異性強以及檢測快速準確。

技術領域

本發明涉及一種番茄花葉病毒的檢測，尤其是涉及一種番茄花葉病毒的RT-RAA-LFS快速可視化檢測引物、探針和試劑盒及應用。

背景技術

番茄花葉病毒（Tomato mosaic virus，ToMV）是Virgaviridae科Tobamovirus屬的正鏈RNA病毒。由于該病毒核酸序列與煙草花葉病毒（TMV）高度同源，因此很長一段時間以來，研究人員都將ToMV作為TMV的一個分支來報道。直到1971年，ToMV才與TMV區別開來，并被分離為獨立的病毒種類。ToMV可以感染茄科、十字花科、禾本科、藜科和豆科等植物，其中辣椒是ToMV的天然宿主之一。受ToMV侵染辣椒通常會產生局部病變，引起植物的系統性壞死，進而嚴重影響辣椒的質量和產量。此外近年來，ToMV還引起了木槿、香瓜茄、苣荬菜、大果茄和龍葵引起的病毒病害的報道。

常用的番茄花葉病毒的檢測方法主要有生物學檢測法，主要通過指示植物作為鑒別寄主進行檢測，然而該方法不僅工作量大，需要較大的溫室種植寄主植物，且比較費時，有時因氣候或栽培等原因，癥狀反應不十分穩定，個別癥狀反應難以重復，因此準確率也不高。酶聯免疫吸附測定（ELISA）也用于檢測ToMV，該方法主要通過研制ToMV的病毒蛋白抗體進行檢測。但ELISA方法對實驗室設備依賴性較強，靈敏度較低。此外，TMV與ToMV之間具有較高的同源性，研究表明，當樣品中兩者的濃度大于等于10-25ng/mL時，ELISA分析則會引起交叉反應，無法清楚地區分TMV和ToMV。RT-PCR法作為植物病毒的傳統檢測方法，在ToMV的檢測方面也已有了較為普遍的應用。通過設計ToMV基因序列的特異性引物，建立ToMV的PCR檢測技術，其檢測靈敏度高，但缺點是依賴PCR法的檢測依然離不開實驗室的變溫儀器，且擴增產物需要凝膠檢測分析結果，從采集病葉至檢測完成，整個過程仍需至少1天的時間，不利于實現田間快速檢測。也有利用多重免疫捕獲RT-PCR法等方法檢測ToMV，此方法需要濃縮并預純化病毒顆粒，然后對捕獲的病毒粒子進行RT-PCR檢測，無需核酸提取。與ELISA比較，該方法將檢測靈敏度提高了4個數量級，但該法同時也具有RT-PCR的缺點。德國Loewe Biochemica公司研制的針對ToMV快速檢測的膠體金抗體試劑盒（Tomato MosaicTobamovirus LOEWE^?FAST Kit），通過研制膠體金顆粒結合抗ToMV的抗體復合物，以該復合物直接結合病汁液中游離的ToMV病毒顆粒，從而在檢測線上呈現肉眼可見的陽性條帶。試劑盒的優點在于：操作簡單，無需較強的專業背景，無需依賴實驗室設備，檢測迅速；缺點在于制備ToMV相應膠體金抗體復合物的試紙條需耗費較高的成本，無法形成規模的田間樣品檢測，其次該方法的靈敏度也有待驗證。此外，還有基于血清學的原理建立的流式細胞儀法，采用檢測熒光的方式讀取結果。制備ToMV的一抗以及標記FITC的二抗，將一抗通過共價鍵的形式與乳膠顆粒結合，取植物病葉提取物在低溫下與乳膠顆粒溫育過夜，PBS洗滌后，與二抗孵育，再次洗滌，用流式細胞儀進行熒光檢測。單獨的ToMV流式細胞儀檢測，其靈敏度達4pg/mL。但該方法缺點是對實驗室設備的依賴性較強，需要一定的專業背景，且該檢測法的前期準備工作繁重，成本較高。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種靈敏度高、特異性強以及檢測快速準確的番茄花葉病毒的RT-RAA-LFS快速可視化檢測引物、探針和試劑盒及應用。

本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為：