[發明專利]番茄花葉病毒的RT-RAA-LFS快速可視化檢測引物、探針和試劑盒及應用

在審

• 申請號: 202110726324.3
• 申請日: 2021-06-29
• 公開（公告）號: CN113430302A
• 公開（公告）日: 2021-09-24
• 發明（設計）人: 鄭紅英;來宇超;宋雪梅;曹宇浩;彭杰軍;魯宇文;陳劍平;燕飛
• 申請（專利權）人: 寧波大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12Q1/6804;C12N15/11;C12R1/94
• 代理公司: 寧波奧圣專利代理有限公司 33226
• 代理人: 何仲

1.一種番茄花葉病毒的RT-RAA-LFS快速可視化檢測引物、探針，其特征在于包括根據番茄花葉病毒的運動蛋白和外殼蛋白區段設計特異性引物及熒光探針，引物序列具體如下：上游引物ToMV-RAA-F5：AGTGCGGGCTACTGCCCTTTGTCATTAGAA；下游引物ToMV-RAA-R5：Biotin-TATTTTTCGGACCTCTTTTTGAGGATTTGGT；探針ToMV-probe-5：FAM-TAATATAAAATTGGGTTTGAGGGAGAAAGTA(THF)CGAGTGTGAACGATGGA-C3-pacer。

2.一種番茄花葉病毒的RT-RAA-LFS快速可視化檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒包括反應體系如下：29.4 μL A 緩沖液，2.1 μL 10 μM的上游引物，3 μL10 μM的下游引物，0.6μL10 μM的探針，1 μL RNA模板，11.4 μL ddH₂O，2.5 μL B 緩沖液，總體積為50 μL，其中引物序列具體如下：上游引物ToMV-RAA-F5：AGTGCGGGCTACTGCCCTTTGTCATTAGAA；下游引物ToMV-RAA-R5：Biotin-TATTTTTCGGACCTCTTTTTGAGGATTTGGT；探針ToMV-probe-5：FAM-TAATATAAAATTGGGTTTGAGGGAGAAAGTA(THF)CGAGTGTGAACGATGGA-C3-pacer。

3.權利要求1所述的番茄花葉病毒的RT-RAA-LFS快速可視化檢測引物、探針的應用，其特征在于用于檢測番茄花葉病毒包括以下步驟：

（1）配制混合液：將29.4 μL A緩沖液，2.1 μL 10 μM的上游引物，3 μL10 μM的下游引物，0.6 μL10 μM的探針，1 μL RNA模板，11.4 μL ddH₂O，2.5 μL B緩沖液加入離心管混合后瞬時離心，用移液器將混合液全部轉移至RNA恒溫快速擴增試劑盒的MIRA反應單元，槍頭輕輕吹打，待管內干粉充分溶解后，瞬時離心；

（2）立即將反應管放入恒溫金屬浴中，39 ℃孵育30 min；

（3）反應結束后，從每個反應管中取出5 μL反應液轉至新的離心管中，用ddH₂O稀釋至50μL，吹打混勻；

（4）將側流層析試紙條結合墊部分浸入液面，待液體向上層析過質控線，取出試紙條平置，5 min內讀取檢測結果并拍照記錄。