[發(fā)明專利]水稻色氨酸脫羧酶及其生產(chǎn)方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110710832.2
• 申請日: 2021-06-25
• 公開（公告）號(hào): CN113430219B
• 公開（公告）日: 2022-06-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 岳明瑞;謝沛;曹華杰;郭永勝;騰義衛(wèi)
• 申請（專利權(quán)）人: 新泰市佳禾生物科技有限公司;汕頭市佳禾生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/60
• 分類號(hào): C12N15/60;C12N9/88;C12N15/70
• 代理公司: 濟(jì)南譽(yù)豐專利代理事務(wù)所(普通合伙企業(yè)) 37240
• 代理人: 薛鵬喜

本發(fā)明公開了一種水稻色氨酸脫羧酶及其生產(chǎn)方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。編碼水稻色氨酸脫羧酶的基因TDC的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。將SEQ ID NO.1所示的基因TDC連入質(zhì)粒pEGX?4t?J，獲得重組表達(dá)載體；再將獲得的重組表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌，獲得重組菌；將重組菌接種至培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，獲得發(fā)酵培養(yǎng)液；向發(fā)酵培養(yǎng)液中加入誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，獲得誘導(dǎo)培養(yǎng)物；對誘導(dǎo)培養(yǎng)物進(jìn)行分離純化，即可制備得到水稻色氨酸脫羧酶。本發(fā)明生產(chǎn)得到的水稻色氨酸脫羧酶表達(dá)水平高、催化活性好。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種水稻色氨酸脫羧酶及其生產(chǎn)方法。

背景技術(shù)

色氨酸脫羧酶(Tryptophan decarboxylase，TDC)是一種5'-磷酸吡哆醛(Pyridoxal-5’-phosphate，PLP)依賴型的脫羧酶，可以催化色氨酸脫羧后產(chǎn)生色胺(王鵬等，2014；López-Meyer et al.,1997)。色氨酸脫羧酶可以來源于植物、動(dòng)物以及微生物。在植物體內(nèi)，色氨酸脫羧酶屬于植物大類中芳香族氨基酸脫羧酶(Aromatic amino aciddecarboxylases，AAADs)家族蛋白中的一類(江晶潔等，2019)，依賴于輔因子5'-磷酸吡哆醛的作用下實(shí)現(xiàn)催化色氨酸脫羧形成色胺的功能，目前已見報(bào)道于喜樹、長春花、短小蛇根草、番茄、印度人參、美麗帽柱木等多種植物中(Jadaun et al.,2017；Pang et al.,2018；Tossaton et al.,2013；Yamazaki et al.,2003)。色氨酸脫羧酶基因在陸生植物中往往以多基因家族形式存在，不同植物來源的色氨酸脫羧酶的氨基酸序列同源性存在差異，催化色氨酸脫羧產(chǎn)生色胺的活性也存在不同。

目前我國的色胺類產(chǎn)品還是主要依賴于進(jìn)口(陳寧等，2017)，價(jià)格相當(dāng)昂貴，亟需開發(fā)出一種綠色的、低成本的、高效的生物合成色胺的新技術(shù)路線。因此通過對色氨酸脫羧酶的分離純化進(jìn)行生物催化合成色胺將具有重要的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容

針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的是提供一種水稻色氨酸脫羧酶及其生產(chǎn)方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明的第一方面，提供一種編碼水稻色氨酸脫羧酶的基因TDC，所述基因TDC的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本發(fā)明的第二方面，提供上述基因TDC編碼的水稻色氨酸脫羧酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本發(fā)明的第三方面，提供一種生產(chǎn)水稻色氨酸脫羧酶的方法，包括以下步驟：

(1)將SEQ ID NO.1所示的編碼水稻色氨酸脫羧酶的基因TDC連入質(zhì)粒pEGX-4t-J，獲得重組表達(dá)載體；再將獲得的重組表達(dá)載體導(dǎo)入大腸桿菌，獲得重組菌；

(2)將重組菌接種至培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)至發(fā)酵培養(yǎng)液稀釋100倍后的OD₆₀₀值為0.18-0.20，獲得發(fā)酵培養(yǎng)液；向發(fā)酵培養(yǎng)液中加入誘導(dǎo)劑進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，獲得誘導(dǎo)培養(yǎng)物；對誘導(dǎo)培養(yǎng)物進(jìn)行高壓均質(zhì)處理，制備得到水稻色氨酸脫羧酶。

優(yōu)選的，步驟(1)中，所述質(zhì)粒pEGX-4t-J是由如下方法構(gòu)建而成：

以pEGX-4T-1為出發(fā)質(zhì)粒，利用pflmⅠ和btgⅠ分別將質(zhì)粒pEGX-4T-1的第3250和4869位點(diǎn)進(jìn)行酶切，酶切之后再連入長度為100bp的人造鏈；所述質(zhì)粒pEGX-4t-J的長度為3449bp，僅在第3249位點(diǎn)處存在SpeⅠ酶切位點(diǎn)，僅在第3349位點(diǎn)處存在Bsc91Ⅰ酶切位點(diǎn)。