[發明專利]一種生產二氫青蒿酸的釀酒酵母工程菌及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 202110708305.8
• 申請日: 2019-11-06
• 公開（公告）號: CN113444654B
• 公開（公告）日: 2022-12-23
• 發明（設計）人: 元英進;曾薄軒;肖文海;姚明東;王穎
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12P7/40;C12R1/865
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 劉猛

本發明涉及微生物技術領域，公開了一種生產二氫青蒿酸的釀酒酵母工程菌。本發明所述工程菌在通過二氫青蒿酸釀酒酵母異源合成途徑改造的釀酒酵母基礎上，使其原有表達ALDH1的序列為表達突變的ALDH1^H194R或ALDH1^V247F的序列。本發明對路徑的關鍵基因ALDH1進行定點突變以獲得選擇性更好的基因，使代謝路徑更偏好二氫青蒿酸的合成，降低青蒿酸所占比例。兩個突變體ALDH1^H194R和ALDH1^V247F在本發明中證明可提高二氫青蒿酸/青蒿酸的比例。在此基礎上，將DBR2和ADH1融合表達，同時將突變ALDH1與DBR2融合表達可進一步提高二氫青蒿酸/青蒿酸比例且不犧牲二氫青蒿酸的產量。

本申請為申請日為2019年11月06日，申請號為201911075759.5，發明創造 名稱為“一種生產二氫青蒿酸的釀酒酵母工程菌及其構建方法和應用”的分 案申請。

技術領域

本發明涉及微生物技術領域，更具體的說是涉及一種生產二氫青蒿酸的 釀酒酵母工程菌及其構建方法和應用。

背景技術

青蒿素是一種有效抗瘧疾藥物，其眾多的衍生物都被世界衛生組織于2002 年認定為一線抗瘧疾藥物。目前，青蒿素的獲得方式主要是從植物青蒿中直 接提取。青蒿在世界各地均有分布，但絕大數青蒿中青蒿素含量都很低 (≤1‰)，且提取成本較高。而化學合成法從頭合成青蒿素，因青蒿素分子 本身結構復雜，導致合成難度高，成本高，在經濟上不可行。而生物半合成 方法獲得青蒿素成為最佳的選擇，即通過基因工程改造微生物使其生產青蒿 素前體青蒿二烯、青蒿酸或二氫青蒿酸等，再通過幾步簡單的化學合成方法 合成青蒿素。

其中，二氫青蒿酸是合成青蒿素的最直接的前體物質，所有其他的前體 物質(如青蒿酸等)都需要用化學方法先合成到二氫青蒿酸，才能進一步合 成青蒿素。

如Paddon CJ等人在2013年利用釀酒酵母先異源合成大量青蒿酸，再通過 化學法合成二氫青蒿酸，進而合成青蒿素。但是，這種先用生物法合成青蒿 酸再用化學法轉化生成二氫青蒿酸的過程中會產生11-S型的手性二氫青蒿酸 作為副產物，這個副產物不能作為后續合成青蒿素的原料的。

而在利用微生物異源直接合成二氫青蒿酸的技術中則可避免這種情形， 例如二氫青蒿酸可以用釀酒酵母直接異源合成，2008年，Zhang Y等人通過表 達DBR2等關鍵基因，首次在釀酒酵母內合成二氫青蒿酸；

二氫青蒿酸是一種倍半萜的衍生物，其已構建出來的釀酒酵母異源生物 合成途徑如下：酵母利用乙醇為碳源，先將其轉化為乙酰-CoA，然后進入甲 羥戊酸(MVA)途徑，合成15個碳的法尼基焦磷酸(FPP)，再以FPP為底物， 通過青蒿二烯合成酶(ADS)的催化合成青蒿二烯，隨后被P450單氧化酶 CYP71AV1氧化為青蒿醇，CPR1和CYB5可輔助這一步驟的進行，之后青蒿醇 在ADH1催化下合成青蒿醛，青蒿醛在DBR2催化下合成二氫青蒿醛，最后經過ALDH1催化生成二氫青蒿酸，同時青蒿醛又可以直接被ALDH1催化生成副 產物青蒿酸，具體合成途徑見圖1。在該途徑中，釀酒酵母所缺少的關鍵酶為 ADS、CYP71AV1、CPR1、CYB5、ADH1、DBR2和ALDH1，在不考慮產量 的前提下，將表達這些酶的序列通過基因整合方式或重組質粒方式，導入到 釀酒酵母中，即可生產處二氫青蒿酸。

專利CN201610876830.X以上述代謝途徑為基礎，將代謝通路所需要的幾 個關鍵酶ADS、CYP71AV1、CPR1、CYB5、ADH1、DBR2和ALDH1通過基 因整合以及質粒導入的方式完成了重組菌株的構建，同時還過表達一些釀酒 酵母內源基因，使釀酒酵母合成二氫青蒿酸的產量可提高到1.17g/L。

雖然利用微生物異源直接合成二氫青蒿酸的技術中，不會出現合成手性 二氫青蒿酸副產物的情況，但是會同時生成青蒿酸作為副產物，現有專利 CN201610876830.X所構建的重組菌株，其二氫青蒿酸/青蒿酸的比例僅為2.53， 這表明青蒿酸在其中所占比例過高，影響目標物質的生成。