[發明專利]一種生產二氫青蒿酸的釀酒酵母工程菌及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 202110708305.8
• 申請日: 2019-11-06
• 公開（公告）號: CN113444654B
• 公開（公告）日: 2022-12-23
• 發明（設計）人: 元英進;曾薄軒;肖文海;姚明東;王穎
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12N15/81;C12P7/40;C12R1/865
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 劉猛

1.一種提高二氫青蒿酸/青蒿酸比例的釀酒酵母工程菌，其特征在于，通過二氫青蒿酸釀酒酵母異源合成途徑改造的釀酒酵母底盤菌株，其原有表達ALDH1的序列為表達突變的ALDH1^V247F的序列；其中，原有ALDH1的序列為GI號為422034338的蛋白序列，ALDH1^V247F即ALDH1第247位的纈氨酸突變為苯丙氨酸。

2.根據權利要求1所述釀酒酵母工程菌，其特征在于，所述釀酒酵母底盤菌株為市售CEN.PK2系釀酒酵母。

3.根據權利要求1所述釀酒酵母工程菌，其特征在于，所述表達突變的ALDH1^V247F的序列為表達ALDH1^V247F的序列或表達DBR2和ALDH1^V247F的融合蛋白的序列。

4.根據權利要求1-3任意一項所述釀酒酵母工程菌，其特征在于，還包括，原有表達DBR2的序列為表達DBR2和ADH1的融合蛋白的序列。

5.權利要求1-4任意一項所述釀酒酵母工程菌在生產二氫青蒿酸或以二氫青蒿酸為中間產物的產品中的應用。

6.ALDH1^V247F及其編碼序列在構建生產二氫青蒿酸的釀酒酵母工程菌中的應用。

7.DBR2和ALDH1^V247F的融合蛋白及其編碼序列在構建生產二氫青蒿酸的釀酒酵母工程菌中的應用。

8.權利要求1所述釀酒酵母工程菌的構建方法，其特征在于，包括：

步驟1、以根據二氫青蒿酸釀酒酵母異源合成途徑改造的底盤菌株作為出發菌株，所述底盤菌株通過基因整合和/或質粒導入的方式至少將ADS、CYP71AV1、CPR1、CYB5、 ADH1、DBR2和ALDH1的編碼序列轉入；

步驟2、若原有表達ALDH1的序列預通過質粒導入的方式轉入底盤菌株，則利用質粒上原有表達ALDH1的序列的兩端酶切位點，對表達突變的ALDH1^V247F的序列進行處理，通過酶切方式替換掉原有表達ALDH1的序列，然后再將質粒轉入底盤菌株；

若原有表達ALDH1的序列是通過基因整合方式轉入底盤菌株，則利用原有表達ALDH1的序列的上、下游序列合成上、下游同源臂，通過OE-PCR和質粒酶切方式將上、下游同源臂與表達突變的ALDH1^V247F的序列連接起來，獲得上游同源臂+表達ALDH1^V247F的序列+下游同源臂的片段，通過電轉化方式將該片段轉入到釀酒酵母中，通過釀酒酵母同源重組機制，利用同源臂替換掉原有表達ALDH1的序列。

9.根據權利要求8所述構建方法，其特征在于，所述ADS、CYP71AV1、DBR2的編碼序列通過質粒導入的方式轉入底盤菌株中，所述CPR1、CYB5、 ADH1和ALDH1通過基因整合的方式轉入底盤菌株中。

10.根據權利要求8或9所述構建方法，其特征在于，還包括：

合成表達DBR2和ADH1的融合蛋白的序列并替換原有表達DBR2的序列。