[發(fā)明專利]一種浮萍瞬時轉(zhuǎn)化方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110706250.7
• 申請日: 2021-06-24
• 公開（公告）號: CN113462716B
• 公開（公告）日: 2023-07-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楊琳;馬旭;王珅;孫津歌
• 申請（專利權(quán)）人: 天津師范大學
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/65;A01H5/00
• 代理公司: 天津創(chuàng)智睿誠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 12251
• 代理人: 李薇

1.一種浮萍瞬時轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1，采集浮萍；

步驟2，采集到的浮萍在液體培養(yǎng)基上進行繼代培養(yǎng)；

繼代培養(yǎng)方法為：將浮萍培養(yǎng)于液體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)條件為23-25℃，光周期為16-18小時/天，光強為95-100?μmol?m^-2?s^-1，每周繼代一次；

所述液體培養(yǎng)基中含有大量元素和微量元素；大量元素為：0.4-0.5mM的MgSO₄·7H₂O、1.4-1.5mM?的Ca(NO₃)₂·4H₂O、1.0-1.2mM的KNO₃、0.4-0.5mM的KH₂PO₄和0.4-0.5mM的Mg(NO₃)₂·6H₂O；微量元素為：50-60μM的CaCl₂·2H₂O、50μ-60M的KCl、6.1-6.3μM?的Na₂MoO₄·2H₂O、69-72μM的H₂BO₃、30-32μM的K₂H₂EDTA·2H₂O、56.7-57.1μM的FeNH₄-EDTA、13.8-14.2μM的MnCl₂·4H₂O、2.8-3.2μM的ZnNa₂EDTA·4H₂O、4.8-5.2μM的CoSO₄·7H₂O和18.6-19.2μM的Na₂-EDTA·2H₂O，配置完成后調(diào)節(jié)pH至5.6-5.8，并進行高壓滅菌處理；

步驟3，活化并提取帶有熒光標記目的基因的農(nóng)桿菌；

步驟4，制備含有Silwet-775和蔗糖的溶菌液，所述Silwet-775的濃度為0.04-0.06%v/v，所述蔗糖的濃度為4-6g/L；

制備溶菌液的量根據(jù)轉(zhuǎn)化所需農(nóng)桿菌和浮萍的量而定；

步驟5，將步驟3得到的帶有熒光標記目的基因的農(nóng)桿菌加入步驟4得到的溶菌液中，使菌體完全溶解于溶菌液中，裂解農(nóng)桿菌使得質(zhì)粒被釋放出來；

步驟6，挑取步驟2得到的完整浮萍，用針頭在浮萍葉片背面扎一個小孔后將浮萍放入步驟5得到的溶菌液中浸泡侵染，將侵染后的浮萍放入浮萍液體培養(yǎng)基中并進行暗培養(yǎng)，得到瞬時侵染浮萍，浸泡侵染時間為15-20min，暗培養(yǎng)時間為24-30h。

2.如權(quán)利要求1所述的浮萍瞬時轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，所述步驟1的浮萍為浮萍科浮萍屬L.minor。

3.如權(quán)利要求1所述的浮萍瞬時轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，所述步驟3中，熒光標記目的基因為GCaMP。

4.如權(quán)利要求1所述的浮萍瞬時轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，所述步驟3的活化提取方法為：首先挑取單菌落在液體LB培養(yǎng)基中并小體積活化菌體24-30h，其次取小體積活化的菌液在液體LB培養(yǎng)基進行大體積活化菌體3-4h；檢測農(nóng)桿菌濃度，待菌體濃度達到OD₆₀₀=0.5-0.6后，離心、棄去上清液得到菌體；離心速度為4000-5000rpm，時間為10-15min。

5.如權(quán)利要求4所述的浮萍瞬時轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，所述液體LB培養(yǎng)基中包括鏈霉素、利福平和卡那霉素，所述鏈霉素的濃度為45-50mg/mL，利福平的濃度為20-25mg/mL和卡那霉素的濃度為45-50mg/mL。

6.如權(quán)利要求1所述的浮萍瞬時轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，所述步驟4中，調(diào)節(jié)所述溶菌液的pH=5.6-5.8。

7.如權(quán)利要求1所述的浮萍瞬時轉(zhuǎn)化方法，其特征在于，所述步驟5中，重懸菌體時，每克農(nóng)桿菌利用6-8ml溶菌液進行重懸。