[發(fā)明專利]一種利用陽離子交換層析純化疏水性蛋白的方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202110700103.9
• 申請日: 2021-06-23
• 公開（公告）號: CN114014906A
• 公開（公告）日: 2022-02-08
• 發(fā)明（設計）人: 汪小鋒;楊忠華;藺智勇
• 申請（專利權）人: 信達生物制藥（蘇州）有限公司
• 主分類號: C07K1/18
• 分類號: C07K1/18
• 代理公司: 上海弼興律師事務所 31283
• 代理人: 王衛(wèi)彬;何敏清

本發(fā)明公開了一種利用陽離子交換層析純化疏水性蛋白的方法。該方法的層析步驟包括平衡、上樣、沖洗和洗脫，在層析過程中所用陽離子洗脫液不包含強電解質成分，所用陽離子沖洗液電導率高于上樣樣品；所述陽離子平衡液、沖洗液和洗脫液所用的鹽包括弱酸鹽和/或磷酸鹽類。本發(fā)明所述的方法能有效去除HCP和聚體，避免陽離子層析洗脫峰出現(xiàn)裂峰或多峰現(xiàn)象，收集的雙特異性抗體的收率和純度較高，均可達90％以上(純度甚至可達99％以上)。

技術領域

本發(fā)明涉及抗體純化技術領域，尤其是涉及一種陽離子交換層析法純化疏水性蛋白的方法。

背景技術

疏水性是抗體分子重要的理化性質，抗體分子疏水性的強弱對陽離子交換層析的填料的選擇和工藝開發(fā)有重要的影響。一般疏水性較強的抗體分子在陽離子交換層析純化過程中更容易出現(xiàn)洗脫多峰，聚合體去除效果較差、穩(wěn)定性差和收率低等問題。以下以疏水性抗體為例作具體介紹。

經過30多年的研究和發(fā)展，單克隆抗體(monoclonal antibody，mAb)藥物在腫瘤和自身免疫疾病治療領域取得了巨大進展，同時也成為了醫(yī)藥領域增長速度最快、最有前景的發(fā)展方向，為常規(guī)治療無效的患者帶來了新的希望。目前通過基因工程改造以及有效的質量控制，大大提高了藥物的親和力、穩(wěn)定性、生物學活性及治療效果。

雙特異性抗體(Bispecific monoclonal antibody，BsAb)能夠實現(xiàn)單個分子同時結合兩個獨特的靶點，對于包括腫瘤和感染性疾病在內的各種適應癥，均觀察到雙特異性抗體比單克隆抗體組合更好的治療效果。同時結合兩個靶點可以實現(xiàn)單克隆抗體無法實現(xiàn)的獨特作用機制，人們對雙特異性抗體作為治療藥物的興趣正在增加。中國專利(申請公布號CN110305210A和專利號CN101896504B)公開了雙特異性抗體的設計和制備方法。中國專利(申請公布號CN107922476A)公開了從包含具有兩條κ輕鏈或其部分的單特異性抗體和具有兩條λ輕鏈或其部分的單特異性抗體的混合物中分離這些雙特異性抗體的方法。

下游純化被認為是單克隆抗體藥物工業(yè)化生產中最具挑戰(zhàn)性的階段之一，目前廣泛采用三步純化策略：樣品捕獲、中度純化和精細純化，該策略工藝復雜、對操作要求嚴格，導致純化成本一般占總生產成本的50％～80％。樣品捕獲通常第一步是用蛋白A親和層析，中度純化和精細純化可采離子交換層析和疏水層析等方法。雙價雙特異性抗體的下游處理很可能利用與單克隆抗體相同的處理策略。雖然不同的單抗純化的平臺工藝都是采用這幾種層析方法，但是具體的參數(shù)不同、填料選擇不同都會產生完全不同的結果。

陽離子交換層析(Cation exchange，CEX)因其高載量、對雜質的選擇性、可擴展性和魯棒性而被廣泛應用于平臺單克隆抗體的純化過程，主要用于去除高聚物，同時能去除宿主蛋白和DNA。mAb等電點一般為中性或者弱堿性，所以陽離子交換填料在抗體的純化工藝中一般適用于結合洗脫模式下操作，mAb在低電導率條件下結合到樹脂上，并且pH低于目標分子的等電點。通過增加電導率或pH來實現(xiàn)mAb的洗脫，可以通過線性梯度或階梯洗脫到預定條件來實現(xiàn)。雜質，特別是高聚合體在CEX填料上通常比mAb產物結合得更緊密，并且可以通過調整洗脫條件和收集范圍從所需組分中分離出來。