[發(fā)明專利]一種利用陽離子交換層析純化疏水性蛋白的方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 202110700103.9 | 申請日： | 2021-06-23 |
| 公開（公告）號： | CN114014906A | 公開（公告）日： | 2022-02-08 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 汪小鋒;楊忠華;藺智勇 | 申請（專利權(quán)）人： | 信達(dá)生物制藥（蘇州）有限公司 |
| 主分類號： | C07K1/18 | 分類號： | C07K1/18 |
| 代理公司： | 上海弼興律師事務(wù)所 31283 | 代理人： | 王衛(wèi)彬;何敏清 |
| 地址： | 215123 江蘇省*** | 國省代碼： | 江蘇;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 利用 陽離子 交換 層析 純化 疏水 蛋白 方法 | ||
1.一種利用陽離子交換層析純化疏水性蛋白的方法，其層析步驟包括平衡、上樣、沖洗和洗脫，其特征在于，在層析過程中所用陽離子洗脫液不包含強(qiáng)電解質(zhì)成分，所用陽離子沖洗液電導(dǎo)率高于上樣樣品；
所述陽離子平衡液、沖洗液和洗脫液所用的鹽包括弱酸鹽和/或磷酸鹽類。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的陽離子交換層析所用填料為含選自由磺酸基(SO32-)、磺甲基(S)、磺丙基(SP)和磷酸基(P)構(gòu)成的群組中的基團(tuán)的強(qiáng)陽離子交換劑或含選自由羧甲基(CM)、羧基(COO-)構(gòu)成的群組中的離子交換基團(tuán)的弱陽離子交換劑，優(yōu)選含磺酸基或磺丙基的強(qiáng)陽離子交換劑；
和/或，所述的陽離子交換層析采用結(jié)合-洗脫模式；
和/或，所述陽離子平衡液、沖洗液和洗脫液為醋酸-醋酸鹽緩沖液、枸櫞酸-枸櫞酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液或者組氨酸鹽緩沖液，優(yōu)選醋酸-醋酸鹽緩沖液；較佳地，所述的陽離子平衡液、沖洗液和洗脫液均不包含強(qiáng)電解質(zhì)成分；
和/或，所述的洗脫為鹽梯度洗脫或者鹽等度洗脫，所述的鹽梯度洗脫優(yōu)選鹽線性梯度洗脫。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述鹽等度洗脫的洗脫液電導(dǎo)率為12.55～17.6mS/cm，pH值為4.8～5.5；
所述的鹽線性梯度洗脫的洗脫液電導(dǎo)率為19.0～25.0mS/cm，pH值為5.0～5.4。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，當(dāng)所述填料為Capto S Impact時，所述的鹽等度洗脫洗脫液電導(dǎo)率的范圍為13.5～15.5mS/cm；當(dāng)所述填料為Poros 50HS時，所述的鹽等度洗脫洗脫液電導(dǎo)率的范圍為12.55～14.75mS/cm。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述沖洗液的pH為4.9～5.5，優(yōu)選5.0；電導(dǎo)率為3.0～10.5mS/cm，優(yōu)選5.7～10.5mS/cm，更優(yōu)選8.0mS/cm；
和/或，所述平衡緩沖液的pH為4.9～5.5，優(yōu)選5.0；電導(dǎo)率為3.0～10.5mS/cm，優(yōu)選5.7～10.5mS/cm，更優(yōu)選8.0mS/cm；
和/或，上樣樣品的電導(dǎo)率為3.74～10.5mS/cm，優(yōu)選3.74～7.55mS/cm。
6.如權(quán)利要求1～5任一項所述的方法，其特征在于，所述的疏水性蛋白為抗體，如雙特異性抗體或者單抗；所述的雙特異性抗體優(yōu)選OX40/PD-L1雙特異性抗體；更優(yōu)選包含特異性結(jié)合PD-L1的單結(jié)構(gòu)域抗原結(jié)合位點和特異性結(jié)合OX40的Fab片段。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述雙特異性抗體包含多肽鏈1：VH-CH1-CH2-CH3-接頭-VHH，以及多肽鏈2：VL-CL；較佳地，所述VHH的CDR1～3分別如序列表中SEQID NO:1～3所示，所述VH的CDR1～CDR3氨基酸序列分別如SEQ ID NO:4～6所示的，且所述VL的CDR1～CDR3分別如SEQ ID NO:7～9所示。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述接頭包含氨基酸序列(Gly4Ser)n，其中n為等于或大于1的正整數(shù)，例如，n為1～7中的正整數(shù)，如，n為1、2、3、4、5或6，所述接頭的氨基酸序列優(yōu)選如序列表中SEQ ID NO:15所示；
和/或，所述VH的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:10所示；
和/或，所述VL的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:11所示；
和/或，所述VHH的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:12所示；
和/或，所述CH1的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:16所示；
和/或，所述CH2-CH3的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:17所示；
和/或，所述CL的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:18所示。
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