[發明專利]一種灌流式培養全懸浮MDCK細胞生產重組禽流感病毒的方法

在審

• 申請號: 202110698280.8
• 申請日: 2021-06-23
• 公開（公告）號: CN113355297A
• 公開（公告）日: 2021-09-07
• 發明（設計）人: 陳宏;趙海源;王博;李莉;楊柳;馮玉強;金燕斌;趙博;孫佰強;付志鵬;崔凱;朱長動;李洋
• 申請（專利權）人: 吉林冠界生物技術有限公司
• 主分類號: C12N7/02
• 分類號: C12N7/02;C12M3/06;C12M1/00;C12R1/93
• 代理公司: 北京超凡宏宇專利代理事務所(特殊普通合伙) 11463
• 代理人: 劉建榮

本發明提供了一種灌流式培養全懸浮MDCK細胞生產重組禽流感病毒的方法，包括：(a)當培養系統中全懸浮MDCK細胞的密度達到7×10⁶?10×10⁶個/mL時，補充培養液將所述MDCK細胞的密度調整至3.5×10⁶?5×10⁶個/mL；(b)接入重組禽流感病毒種毒，進行病毒擴增培養；(c)當病毒血凝價HA≥1:512時，分離并收獲病毒液；(d)向所述培養系統中補入新鮮培養液，繼續培養；(e)重復步驟(c)?(d)進行病毒液的多次分離和收獲，直至所述培養系統中細胞密度低于2×10⁶個/mL后終止收獲。本發明方法可穩定實現連續增殖重組禽流感病毒，一次性接入種毒，可連續收獲3?4批次病毒。

技術領域

本發明涉及生物工程技術領域，尤其是涉及一種灌流式培養全懸浮MDCK細胞生產重組禽流感病毒的方法。

背景技術

相對于傳統的批次培養和補料批次培養方式，連續灌注培養能用更小的設備表達更多的產物，同時還能有效改善產品質量，因此，目前的現有技術中廣泛應用連續流工藝(灌流式)培養模式。在連續流工藝培養模式中，補料營養成分連續加入，有害代謝產物會及時去除，從而使得細胞在長時間內維持高密度培養和高活率，這樣不僅讓細胞處于平衡穩定狀態，增殖的產物具備高度一致性，連續地進行病毒的增殖與收獲也能最大程度的保證產品的穩定性。

從禽流感病毒的增殖特性來看，一般將病毒增殖分為四個過程：病毒的吸附、穿膜和脫殼——病毒基因組的復制及其他成分合成——病毒粒子的裝配——病毒的出芽和釋放。病毒成熟的最后一步是靠宿主的蛋白酶將HA(血凝素)裂解為HA1和HA2，使病毒粒子具有感染性，而且這一過程可在細胞外完成，此時剩余的細胞還可以支撐病毒的再次感染、裝配、出芽釋放。基于病毒的這種特性，可以實現一次性接入種毒，連續多批次從反應器收獲病毒。

然而，現有的利用全懸浮MDCK細胞增殖重組禽流感病毒使用的是批次培養的方法，一批次細胞培養好之后接入種毒，培養到收獲時間時一次性全部收獲，收獲的病毒液中還含有大量的健康細胞沒有被有效利用，反而后期還要通過純化的手段去除這些細胞，病毒液才能得以使用。此種方法生產重組禽流感滅活疫苗一方面需要足夠數量的大型反應器來實現，硬件設備的投入較大，培養一批次全懸浮細胞只能進行一批次的病毒增殖，收獲一批次病毒液就需要準備一次反應器，消耗大量的人力與能耗；另一方面，批次培養的細胞如果出現差異和不穩定的情況，增殖病毒的批間差異就會較大，造成疫苗質量的不穩定。

鑒于此，特提出本發明。

發明內容

本發明的目的在于提供一種灌流式培養全懸浮MDCK細胞生產重組禽流感病毒的方法，本發明的方法可在5升-1000升反應器上以穩定實現連續增殖重組禽流感病毒，培養一批次細胞、一次性接入種毒，可連續收獲3-4批次病毒。

本發明提供的技術方案如下：

一種灌流式培養全懸浮MDCK細胞生產重組禽流感病毒的方法，包括：

(a)當培養系統中全懸浮MDCK細胞的密度達到7×10⁶-10×10⁶個/mL時，補充培養液將所述MDCK細胞的密度調整至3.5×10⁶-5×10⁶個/mL；

(b)接入重組禽流感病毒種毒，進行病毒擴增培養；

(c)當病毒血凝價HA≥1:512時，分離并收獲病毒液；

(d)向所述培養系統中補入新鮮培養液，繼續培養；

(e)重復步驟(c)-(d)進行病毒液的多次分離和收獲，直至所述培養系統中細胞密度低于2×10⁶個/mL后終止收獲。