[發明專利]一種灌流式培養全懸浮MDCK細胞生產重組禽流感病毒的方法

在審

• 申請號: 202110698280.8
• 申請日: 2021-06-23
• 公開（公告）號: CN113355297A
• 公開（公告）日: 2021-09-07
• 發明（設計）人: 陳宏;趙海源;王博;李莉;楊柳;馮玉強;金燕斌;趙博;孫佰強;付志鵬;崔凱;朱長動;李洋
• 申請（專利權）人: 吉林冠界生物技術有限公司
• 主分類號: C12N7/02
• 分類號: C12N7/02;C12M3/06;C12M1/00;C12R1/93
• 代理公司: 北京超凡宏宇專利代理事務所(特殊普通合伙) 11463
• 代理人: 劉建榮

1.一種灌流式培養全懸浮MDCK細胞生產重組禽流感病毒的方法，其特征在于，包括：

(a)當培養系統中全懸浮MDCK細胞的密度達到7×10⁶-10×10⁶個/mL時，補充培養液將所述MDCK細胞的密度調整至3.5×10⁶-5×10⁶個/mL；

(b)接入重組禽流感病毒種毒，進行病毒擴增培養；

(c)當病毒血凝價HA≥1:512時，分離并收獲病毒液；

(d)向所述培養系統中補入新鮮培養液，繼續培養；

(e)重復步驟(c)-(d)進行病毒液的多次分離和收獲，直至所述培養系統中細胞密度低于2×10⁶個/mL后終止收獲。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步驟(c)中，分離病毒液后將健康細胞留至所述培養系統中，留下的細胞液的體積為原體積的1/30-1/40。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(c)中，分離并收獲病毒液的方法包括：降溫沉降法抽取病毒液上清或使用微膜過濾細胞截留設備收獲病毒液。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述降溫沉降法抽取病毒液上清包括：將反應系統的溫度降至10℃-15℃，靜置沉降2-4小時；

靜置沉降結束后，當細胞數低于0.5×10⁵個/mL時抽取上清進行病毒液收獲。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(b)中，所述重組禽流感病毒種毒的接入量為所述培養系統中細胞液總體積的0.001％-0.01％。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(b)中，在接入所述重組禽流感病毒種毒的同時，還添加胰蛋白酶；優選地，所述胰蛋白的添加量為3-8μg/mL。

7.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟(b)中，所述病毒擴增培養的條件為pH值6.9-7.3，溶氧30-50％，溫度32-35℃。

8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步驟(d)中，向所述培養系統中補入新鮮細培養液的量為使得細胞液的體積達到分離前的原始體積；

優選地，所述培養液包括細胞培養液或接毒維持液中的一種或多種；

更優選地，所述培養液為所述細胞培養液和所述接毒維持液的混合物；優選體積比1:1的混合物。

9.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，在所述步驟(d)中，還包括添加胰蛋白酶；優選地，所述胰蛋白的添加量為3-8μg/mL。

10.根據權利要求1-9任一項所述的方法，其特征在于，所述培養系統為灌流式細胞培養生物反應器。