[發明專利]能夠用于培養PRRSV獲得高病毒含量病毒液的Marc-145細胞株的篩選方法

在審

• 申請號: 202110697711.9
• 申請日: 2021-06-23
• 公開（公告）號: CN113406337A
• 公開（公告）日: 2021-09-17
• 發明（設計）人: 孔彩平;朱旭;俎紅麗;趙麗霞;李敏;烏日罕;劉燕軍;孫慧;王娥娥;郝蘇云;韓冬;張海寶;喬煜婷;郝鵬
• 申請（專利權）人: 金宇保靈生物藥品有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/577;C12N5/071
• 代理公司: 北京尚誠知識產權代理有限公司 11322
• 代理人: 葉占洋;魯兵

本發明公開一種能夠用于培養PRRSV獲得高病毒含量病毒液的Marc?145細胞株的篩選方法，屬于生物工程技術領域。本發明提供的方法包括利用間接免疫熒光法檢測由候選Marc?145單克隆細胞株繁殖形成的Marc?145單克隆細胞群中細胞表面存在CD163受體的細胞占Marc?145細胞群的百分比，再根據該百分比篩選出能夠用于培養PRRSV獲得高病毒含量病毒液的Marc?145細胞株，具有快速、方便、客觀、準確的優勢，還能夠基于此預測由Marc?145細胞群培養PRRSV獲得的病毒液中病毒含量，可以指導疫苗生產。

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種能夠用于培養PRRSV獲得高病毒含量病毒液的Marc-145細胞株的篩選方法，特別涉及一種利用免疫熒光方法檢測細胞表面CD163受體從而快速、方便、客觀、準確篩選能夠用于培養PRRSV獲得高病毒含量病毒液的Marc-145細胞株的方法，以及利用免疫熒光方法檢測Marc-145細胞表面CD163受體來預測利用該細胞體外培養增殖PRRSV所獲得的病毒液中病毒含量的方法及其在疫苗制備中的應用。

背景技術

豬繁殖和呼吸障礙綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS，俗稱藍耳病)是由豬繁殖和呼吸綜合征病毒(porcine reproductive andrespiratory syndrome virus，PRRSV，俗稱藍耳病毒)所引起的一種接觸性傳染病，主要侵害豬的呼吸系統和繁殖系統。豬被該病毒感染后，先在局部易感巨噬細胞中復制，然后迅速向全身淋巴組織和肺部擴散。大約一周左右，病豬出現高燒不退、腹瀉等癥狀，懷孕母豬染病后易流產、早產、產死胎等。目前豬場針對豬繁殖和呼吸障礙綜合征主要以PRRSV疫苗預防為主，其中在PRRSV疫苗的生產中主要采用哺乳動物細胞作為PRRSV增殖的基質，具有重復性高、生產穩定、抗原特異性更接近自然株、變態反應少等優勢。

Marc-145細胞屬于恒河猴腎細胞系，是目前PRRSV體外增殖的最主要宿主細胞，也是最適用于生產PRRSV疫苗的哺乳動物細胞之一。目前，國內外PRRSV疫苗生產時，常采用貼壁培養的Marc-145細胞或懸浮培養的Marc-145細胞增殖病毒PRRSV，收獲的病毒液中病毒含量的高低是決定疫苗質量和疫苗效力的關鍵因素，因此篩選能夠用于培養PRRSV獲得高病毒含量的病毒液的Marc-145細胞株對于PRRSV疫苗的研究和生產具有重要意義。

現有技術中，用于培養PRRSV以獲得高病毒含量病毒液的Marc-145細胞株的篩選方法普遍為病毒感染法(例如專利文獻CN103966157A，以下稱文獻1)，其利用不同的Marc-145細胞株在96孔培養板中長滿單層細胞(稱為Marc-145單克隆細胞群)后接種PRRSV，共培養48h后觀察細胞病變情況，挑選細胞病變明顯的細胞株用于體外培養增殖PRRSV，以獲得高病毒含量的病毒液。由于病毒感染后的細胞病變情況直接反應該病毒在該細胞的培養體系中的增殖能力和毒力大小，進而可以準確、客觀篩選出能夠用于培養PRRSV以獲得高病毒含量病毒液的Marc-145細胞株。然而，上述文獻1公開的病毒感染法在篩選能得到高病毒含量的細胞株過程中需要向待篩選細胞株中接種病毒，隨后還需共培養48h左右以觀察細胞病變情況，因此存在操作繁瑣、費時長的問題，并且在接種病毒過程中還可能存在感染的風險。

發明內容

針對現有技術中存在的一個或多個問題，本發明一個方面提供一種能夠用于培養PRRSV獲得高病毒含量病毒液的Marc-145細胞株的篩選方法，其包括以下步驟：

檢測：利用間接免疫熒光法檢測由候選Marc-145單克隆細胞株繁殖形成的Marc-145單克隆細胞群中細胞表面存在CD163受體的細胞占Marc-145細胞群的百分比；

篩選：將所述百分比≥50％對應的候選Marc-145單克隆細胞株作為能夠用于培養PRRSV獲得高病毒含量病毒液的Marc-145細胞株；