[發明專利]一種提高利妥昔單抗抗腫瘤效應的方法及應用

有效

• 申請號: 202110697641.7
• 申請日: 2021-06-23
• 公開（公告）號: CN113546181B
• 公開（公告）日: 2023-05-26
• 發明（設計）人: 宋國齊
• 申請（專利權）人: 南通大學附屬醫院
• 主分類號: A61K48/00
• 分類號: A61K48/00;A61K47/68;A61P35/00
• 代理公司: 重慶市信立達專利代理事務所(普通合伙) 50230
• 代理人: 劉潔

本發明屬于生物工程技術領域，公開了一種提高利妥昔單抗抗腫瘤效應的方法及應用，包括：通過脂質納米顆粒包裝特異性PIG?A的sgRNA及cas9mRNA；利用脂質納米粒傳輸系統偶聯CD20抗體，精準靶向B?NHL淋巴瘤細胞淋巴瘤細胞PIG?A；通過編輯所述B?NHL細胞的PIG?A，使所述細胞內GPI合成障礙，使細胞外錨連蛋白CD59在內的蛋白丟失。本發明通過基因編輯PIG?A，減少GPI的合成及CD59、CD55等錨連蛋白的表達及分布，可以大幅度提升利妥昔單抗的藥物敏感性及腫瘤殺傷作用；使用脂質納米粒傳輸系統偶聯CD20抗體，能夠使利妥昔單抗耐藥B?NHL細胞在初始治療中殺傷99％的淋巴瘤細胞。

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，尤其涉及一種提高利妥昔單抗抗腫瘤效應的方法及應用。

背景技術

目前，B細胞性非霍奇金淋巴瘤(B-cell?Non-Hodgkin’s?lymphoma，-NHL)，約占所有NHL的約70％，大多具有侵襲性及異質性。以頸部或鎖骨上無痛性淋巴結腫大為首發表現，可累及全身各個器官，其臨床表現復雜，病程長短不一。隨著我國人口老齡化加劇，慢性感染、不良生活方式、環境污染等危險因素的累加，B-NHL發病率逐年增高，發病年齡不斷前移。目前標準CHOP(環磷酰胺+阿霉素+長春堿+潑尼松)方案化療聯合人鼠嵌合型抗CD20單克隆抗體-利妥昔單抗免疫靶向治療(R-CHOP方案)仍然是一線化療方案。利妥昔單抗能結合B-NHL細胞表面的CD20抗原，通過補體依賴的細胞毒反應(Complement-dependentcytotoxicity，CDC)、抗體依賴細胞介導的細胞毒反應(Antibody-dependent?cell-mediated?cytotoxicity，ADCC)、誘導細胞凋亡和抑制相關細胞信號通路等作用直接殺滅腫瘤細胞，并對化療有增敏作用。采取一線化療患者的5年生存率在60％-70％，但仍有超過30％的患者會因對靶向及化療藥物耐藥而發展為復發/難治性B-NHL，致預后不良，其中很多患者表現出對利妥昔單抗耐藥。通過增加利妥昔單抗用量及更換其他方案甚至造血干細胞移植等方法，延緩了疾病進展、延長了復發難治B-NHL患者的生存期，但是仍不能從根本上解決利妥昔單抗耐藥及治愈此類患者。

CDC效應通過特異性抗體與抗原結合激活補體經典途徑，最終形成膜攻擊復合物(membrane?attack?complex，MAC)裂解靶細胞，是利妥昔單抗殺滅腫瘤細胞的主要作用機制。補體調節因子CD59以同源方式限制C8和/或C9結合、抑制膜攻擊復合物MAC的生成、阻斷補體激活途徑的末端通路，進而導致CDC效應變化。Macor等使用特異性雙抗CD55及CD59抗體封閉慢性淋巴細胞白血病細胞膜上CD55及CD59蛋白，可使抗CD20抗體效能增加數倍。但是現有方法都不能從根本上逆轉利妥昔單抗耐藥，且不具有B系淋巴瘤細胞的靶向性。

CD59是膜攻擊復合物抑制因子，同時也是一種通過糖基磷脂酰肌醇(GPI)錨定于細胞膜表面的補體調節蛋白。有研究發現：CD59突變可抑制MAC生成、阻斷補體激活途徑末端通路，是諸多疾病的發病基礎。GPI錨可使蛋白質與細胞膜穩定結合，其缺失和破壞導致諸如CD55、CD59等細胞膜蛋白丟失，因此GPI錨的正常合成對膜蛋白在細胞膜表達必不可少。在哺乳動物中主要由三個基因(PIG-A、PIG-H和PIG-C)介導完成。其中，PIG-A編碼GPI結構早期合成所必需的酶，有研究使用外源性誘導劑致大鼠PIG-A基因突變，可使大鼠紅細胞膜表面CD59表達丟失。因此誘導B-NHL細胞中PIG-A突變以提高利妥昔單抗藥物敏感性的方法尚未見報道。

CRISPR/Cas9(Clustered?Regularly?Interspaced?Short?PalindromicRepeats/CRISPR?associated?genes?9)是一種基因編輯技術，可對靶基因進行特定DNA修飾。另有研究使用CRISPR/Cas9系統在人體內靶向編輯特定基因治療血友病及遺傳學紅細胞疾病進入了臨床實驗，有望在不遠的將來進入臨床，從而治愈該類疾病患者。目前現有的CRISPR/Cas9系統多由腺病毒包裝傳輸，受限于腺病毒的承載能力，尚不能對PIG-A-CRISPR/Cas9做過多的修飾，以提高該系統的精準靶向B淋巴瘤細胞。