[發明專利]一種人源BAV-TAA疾病多能干細胞模型的構建方法

有效

• 申請號: 202110696403.4
• 申請日: 2021-06-23
• 公開（公告）號: CN113430229B
• 公開（公告）日: 2022-11-22
• 發明（設計）人: 王永煜;張歡;金培峰
• 申請（專利權）人: 溫州醫科大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N5/10;C12N15/12;C12Q1/02
• 代理公司: 北京東方盛凡知識產權代理有限公司 11562
• 代理人: 程小芳

本發明公開了一種人源BAV?TAA疾病多能干細胞模型的構建方法，屬于細胞模型技術領域；該構建方法包括以下步驟：對離體的BAV/TAA患者來源的血管組織進行體外培養，獲得原代細胞；通過電轉方法將含有重編程因子的附加體質粒導入所述原代血管細胞進行重編程，得到特異性iPSC細胞株；對所述特異性iPSC細胞株進行定向分化，得到人源BAV?TAA疾病血管細胞模型。通過將體外分離的患者原代血管細胞重編程成為誘導多能干細胞，然后通過擴增并將其定向誘導分化，從而源源不斷獲得所需的細胞模型，為該疾病的研究提供大量特定細胞類型。

技術領域

本發明涉及細胞模型領域，特別是涉及一種人源BAV-TAA疾病多能干細胞模型的構建方法。

背景技術

主動脈瓣二葉畸形(Bicuspid aortic valve，BAV)是一種常見的先天性心臟病，發病率為1-2％，常表現為胸主動脈瘤(TAA)，雖然之間的關系已經確立，但到目前為止，導致BAV-TAA的確切分子和細胞機制仍不完全清楚。流行病學研究表明，BAV-TAA的一些高危因素，包括年齡增加、糖尿病和高膽固醇血癥、主動脈瓣關閉不全、吸煙以及遺傳缺陷。據報道，BAV在家系中聚集，一些基因，如NOTCH1，GATA5，ROBO4突變與其相關。據報道，還有30多個基因突變與胸主動脈瘤有關。從BAV-TAA獲得患者特異性iPSC可能為闡明BAV-TAA的分子機制提供一種新的體外人類細胞模型。迄今為止，關于BAV-TAA疾病發生的分子機制研究并不清楚，且存在很大爭議。目前，胸主動脈瘤的研究主要在動物水平上進行，由于種屬差異，動物模型與人類在各種生理系統上存在很大差異，很多研究結果不能直接應用于人類疾病。因此，如何建立一個“人源性”血管細胞模型對于BAV-TAA等心血管疾病的研究十分重要。

人誘導多能干細胞(human induced pluripotent stem cells，hiPSCs)的出現為轉化醫學和再生醫學提供了革命性的技術，也為人類遺傳性疾病的疾病模型機制研究提供了新手段和大量細胞來源。最初，2006年日本京都大學Shinya Yamanaka在世界著名學術雜志《細胞》上率先報道了誘導多能干細胞的研究。他們把Oct3/4,Sox2、c-Myc和Klf4這四種轉錄因子基因克隆入病毒載體，然后引入小鼠成纖維細胞，發現可誘導其發生轉化，產生的iPS細胞，在形態、基因和蛋白表達、表觀遺傳修飾狀態、細胞倍增能力、類胚體和畸胎瘤生成能力、分化潛能等方面都與胚胎干細胞相似。2007年11月，Thompson實驗室和Yamanaka實驗室幾乎同時報道，利用重編程技術同樣可以誘導人皮膚纖維細胞成為幾乎與胚胎干細胞完全一樣的iPSCs?；谡T導多能干細胞的產生與運用，對細胞模型的構建提供了新途徑，而目前還沒有BAV-TAA疾病多能干細胞模型構建的相關報道。

發明內容

本發明的目的是提供一種人源BAV-TAA疾病多能干細胞模型的構建方法，以解決上述現有技術存在的問題，通過將體外分離的患者原代細胞重編程成為誘導多能干細胞，然后通過擴增并將其定向誘導分化，從而源源不斷獲得所需的細胞模型，為該疾病的研究提供大量特定細胞類型。

為實現上述目的，本發明提供了如下方案：

本發明提供一種人源BAV-TAA疾病多能干細胞模型的構建方法，包括以下步驟：

對離體的BAV/TAA患者來源的血管組織進行體外培養，獲得原代血管細胞；

通過電轉方法將含有重編程因子的附加體質粒導入所述原代血管細胞進行重編程，得到特異性iPSC細胞株；

對所述特異性iPSC細胞株進行定向分化，得到人源BAV-TAA疾病血管細胞模型。

優選的是，所述原代血管細胞的獲得包括以下步驟：

對獲取的離體BAV-TAA患者主動脈組織塊剪成約1mm3小塊，并貼附于培養瓶，加入含10％胎牛血清和1％青鏈霉素的DMEM培養基，貼附組織塊一面朝上培養一段時間后，翻轉培養瓶，繼續培養，至大量細胞長出，進一步擴增，得到原代血管細胞。