[發明專利]一種人源BAV-TAA疾病多能干細胞模型的構建方法

有效

• 申請號: 202110696403.4
• 申請日: 2021-06-23
• 公開（公告）號: CN113430229B
• 公開（公告）日: 2022-11-22
• 發明（設計）人: 王永煜;張歡;金培峰
• 申請（專利權）人: 溫州醫科大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N5/10;C12N15/12;C12Q1/02
• 代理公司: 北京東方盛凡知識產權代理有限公司 11562
• 代理人: 程小芳

1.一種內皮細胞分化異常的人源BAV TAA疾病多能干細胞模型的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

對離體的BAV/TAA患者來源的血管組織進行體外培養，獲得原代血管細胞；所述血管細胞包括成纖維細胞和血管平滑肌細胞；

通過電轉方法將含有重編程因子的附加體質粒導入所述原代血管細胞進行重編程，得到特異性iPSC細胞株；所述重編程因子的附加體質粒包括含有重編程因子基因OCT4、KLF4、SOX2、Lin28、l-myc以及shP53的質粒；

對所述特異性iPSC細胞株進行定向分化，得到人源BAV-TAA疾病血管細胞模型；

所述特異性iPSC細胞株的獲得包括以下步驟：

步驟1：待所述血管細胞培養至細胞密度80-90％時，消化成單個細胞，離心，取細胞沉淀；

步驟2：將含重編程因子的附加體質粒與電轉液混合后，重懸所述細胞沉淀，然后進行電轉；

步驟3：電轉之后加入培養液重懸細胞，再將細胞懸液接種于含有10％胎牛血清和1％青鏈霉素的DMEM培養基中，每天換液，直至培養細胞密度90％，進行細胞消化，并將消化后的細胞接種到混合液-1中，培養一天后，更換成所述混合液-2，待觀察到特異性iPSC細胞株克隆時，更換成培養液，獲得所述單克隆細胞；所述混合液-1包括：(hiPSC/hESC培養液+10ng/ml Human bFGF+0.25mM NaB):(DMEM+10％FBS+1％青鏈霉素培養基)體積比為1:1混合而成；所述混合液-2包括：hiPSC/hESC培養液+10ng/ml Human bFGF+0.25mM NaB；所述培養液為：hiPSC/hESC培養液；

步驟4：將所述單克隆細胞與周圍原代血管細胞分離后，用所述培養基擴增培養，得到特異性iPSC細胞株；

對所述特異性iPSC細胞株進行定向分化包括以下步驟：

S1：將所述特異性iPSC細胞株接種于所述培養液培養，得到待分化細胞；

S2：將所述待分化細胞在N2B27-1培養基中進行第一次分化培養，得到第一次分化后細胞；所述N2B27-1培養基包括：N2B27培養基+1μM CP21R7+25μg/ml BMP4；

S3：將所述第一次分化后細胞在N2B27-2培養基中進行第二次分化培養，得到第二次分化后細胞，即為人源BAV-TAA疾病多能干細胞來源的平滑肌細胞；所述N2B27-2培養基包括：N2B27培養基+10ng/ml PDGF-BB+2ng/ml Activin A；

S4：將所述第一次分化后細胞在StemPro-34 SFM(1X)培養基中進行第二次分化培養，得到第三次分化后細胞，即為人源BAV-TAA疾病多能干細胞來源的內皮細胞模型；所述StemPro-34 SFM(1X)培養基包括StemPro-34 SFM(1X)+200ng/ml的VEGF和2uM Forskolin；

其中，所述N2B27培養基中，DMEM-F12+神經細胞基礎培養基各占總培養液量的48.5％，不包含維生素A的B27占總培養液總量的2％，N2占總培養液總量的1％。

2.根據權利要求1所述的內皮細胞分化異常的人源BAV TAA疾病多能干細胞模型的構建方法，其特征在于，所述原代血管細胞的獲得包括以下步驟：

對獲取的離體BAV-TAA患者主動脈組織塊剪成約1mm小塊，并貼附于培養瓶，加入含10％胎牛血清和1％青鏈霉素的DMEM培養基，貼附組織塊一面朝上培養一段時間后，翻轉培養瓶，繼續培養，至大量細胞長出，進一步擴增，得到原代血管細胞。

3.根據權利要求1-2任一項所述的構建方法構建的內皮細胞分化異常的人源BAV-TAA疾病多能干細胞模型。

4.根據權利要求1-2任一項所述的構建方法或權利要求3所述的內皮細胞分化異常的人源BAV-TAA多能干細胞疾病模型在如下(a)或(b)中的應用：

(a)制備用于篩選治療和/或預防BAV-TAA疾病的臨床藥物中的應用；

(b)研究BAV-TAA相關疾病的細胞分子機制中應用。