[發明專利]一種高效的外泌體分離純化方法

有效

• 申請號: 202110695490.1
• 申請日: 2021-06-23
• 公開（公告）號: CN113249302B
• 公開（公告）日: 2021-10-08
• 發明（設計）人: 張怡然;顧麗清;段小紅;陳玉潔;王麗芬;周啟明
• 申請（專利權）人: 北京求臻醫學檢驗實驗室有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 重慶百潤洪知識產權代理有限公司 50219
• 代理人: 陳付玉

本發明涉及分子生物技術領域，特別涉及一種高效的外泌體分離純化方法，包括分離血漿，加入陽離子聚合物孵育；濾膜截留與陽離子聚合物結合的外泌體并漂洗外泌體；離液劑洗脫外泌體；加入磁珠吸附并富集外泌體；洗脫獲得外泌體濃縮液。與現有技術相比，本發明不借助大型離心設備，采用陽離子聚合物對外泌體進行包覆后，采用離液劑解除陽離子聚合物與外泌體作用，通過簡單的過濾，實現外泌體回收，然后通過磁性吸附劑對回收的外泌體進行濃縮，純化。本發明有效縮短分離時間、提高外泌體回收效率、提高處理樣本通量、提升外泌體分離純度、降低外泌體分離所需試劑及耗材成本，分離得到的高純度外泌體可用于核酸提取Westernblot、粒徑分析、電鏡檢測等實驗。

技術領域

本發明涉及分子生物技術領域，特別涉及一種高效的外泌體分離純化方法。

背景技術

外泌體(Exosomes)是細胞經過內吞-融合-外排等一系列調控過程而形成的直徑在30～150nm的圓形單層膜結構的細胞外小囊泡。外泌體由機體眾多類型細胞釋放，并廣泛分布于唾液、血漿、乳汁、尿液等體液當中，可以攜帶蛋白，運送RNA，在細胞間物質和信息轉導中起重要作用。外泌體的發現豐富了研究者們對細胞間通訊方式的認識，加深了對機體生理、病理過程的理解，2013年諾貝爾生物/醫學獎授予了三位在細胞囊泡方面貢獻突出的科學家，使外泌體的研究達到全新的高度。

近年來，隨著人們對外泌體的研究和認識加深，外泌體檢測作為一種新型的液體活檢熱點技術已被許多臨床科研機構廣泛地應用于腫瘤和疾病的無創診斷、治療和監測；如何高效地提取外泌體是實現這項新興液體活檢技術臨床常規化應用的關鍵。外泌體作為液體活檢的三大領域之一，其潛在的生物靶標眾多，但能同時將微量核酸和蛋白，通常，為獲取純度高的外泌體，需要應用到外泌的分離技術。

目前外泌體的分離技術有超速離心法、分子排阻法、免疫捕獲法、PEG沉淀等方法。超速離心一般需要7小時以上，且耗時耗力、所需儀器設備昂貴，很難獲得足夠量的外泌體用于后續的實驗分析；分子排阻法即免疫捕獲法所收集的外泌體量少，且費用高昂；PEG沉淀法雖然可以大規模分離外泌體，但是在收集到大量外泌體的同時不可避免的引入脂蛋白，造成分離所得外泌體純度低的問題。由于國內有關外泌體提取試劑的缺乏，我國對外泌體的研究還基本依賴于過程繁瑣的超速離心和進口提取試劑盒，因此，嚴重阻礙了我國在外泌體的研究和臨床應用上的發展。如何尋求一種能夠高效分離外泌體并保證外泌體純度的方式是本技術領域迫切需要解決問題。

發明內容

針對以上述背景技術的不足，本發明提供一種高效的外泌體分離純化方法。

本發明采用的技術方案如下：一種高效的外泌體分離純化方法，關鍵在于包括以下步驟：

S1. 向體液中加入陽離子多聚物，在2-10℃孵育5-30 min；

S2. 將體液混合物過濾后，截留物依次加入低濃度離液劑、高濃度離液劑進行洗脫，得到外泌體初分離物；

S3. 將外泌體初分離物中加入磁性吸附劑，在15-35℃孵育2-20 min后，去除清液，取出磁性吸附劑；

S4. 向磁性吸附劑加入氨水重懸，在15-35℃孵育2-20 min后，取出清液，得到高純度外泌體。

優選的，所述生理性流體包括以下的流體：鼻咽、口腔、食道、胃、胰腺、肝、胸膜、心包、腹膜、腸、前列腺、精液、陰道分泌物、眼淚、唾液、粘液、膽汁、血液、淋巴、血漿、血清、滑液、腦脊液、宮腔及附件、尿，以及間隙、細胞內和細胞外的流體；優選是血液、血漿和血清。

優選的，S1中所述陽離子多聚物為多聚賴氨酸。

優選的，S2中采用孔徑為0.1-0.3 μm濾膜過濾。

優選的，S2中所述低濃度離液劑為0.5-2.5M異硫氰酸胍。

優選的，S2中所述高濃度離液劑為4-6M異硫氰酸胍。