[發(fā)明專利]含佐劑基因的羊支原體肺炎二價(jià)核酸疫苗的構(gòu)建方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110693336.0
• 申請日: 2021-06-22
• 公開（公告）號(hào): CN113444743A
• 公開（公告）日: 2021-09-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 程振濤;楊鵬;張雙翔;岳筠;吳燕;袁林
• 申請（專利權(quán)）人: 貴州大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/85
• 分類號(hào): C12N15/85;C12N15/66;C12N15/64;C12N15/62;A61K39/02;A61K39/39;A61P11/00;A61P31/04;C12R1/35
• 代理公司: 合肥華利知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 34170
• 代理人: 蔣玉嬌

本發(fā)明公開了含佐劑基因的羊支原體肺炎二價(jià)核酸疫苗的構(gòu)建方法，具體步驟如下：步驟一、Mo/Mmc基因組的提取：S1、Mo/Mmc貴州株的復(fù)蘇與培養(yǎng)；S2、Mo/Mmc貴州株DNA的提取；步驟二、P113?LppA?IL?2融合基因擴(kuò)增：S1、粘膜免疫佐劑基因、綿羊肺炎支原體和絲狀支原體山羊亞種抗原基因擴(kuò)增；S2、P113?LppA融合基因擴(kuò)增；S3、P113?LppA?IL?2融合基因擴(kuò)增；步驟三、含粘膜免疫佐劑基因的羊支原體肺炎二價(jià)核酸疫苗的制備。本發(fā)明通過選擇兩個(gè)不同抗原基因和黏膜免疫佐劑基因研制出核酸疫苗，可有效針對(duì)羊支原體肺炎DNA疫苗免疫效果弱等問題，解決目前疫苗研發(fā)所面臨的諸多問題。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及疫苗構(gòu)建技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及含佐劑基因的羊支原體肺炎二價(jià)核酸疫苗的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)

羊支原體肺炎是由絲狀支原體山羊亞種(Mycoplasma mycoides subsp. Capri,Mmc)、綿羊肺炎支原體(Mycoplasma ovipneumoniae,Mo)和山羊支原體山羊亞種(Mycoplasma capricolum subsp.Capricolum,Mcc)等支原體引起的在羊群中普遍流行的接觸性傳染病，纖維素性肺炎和胸膜炎是其主要特征，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列為B類傳染病。近年來，我國多個(gè)養(yǎng)羊業(yè)發(fā)達(dá)的省區(qū)均有羊支原體肺炎的發(fā)生和流行的報(bào)道，疫病的流行嚴(yán)重影響著養(yǎng)羊業(yè)的健康發(fā)展，危害日趨加重，給全國養(yǎng)羊業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，且我國該病病原以綿羊肺炎支原體和絲狀支原體山羊亞種兩種病原為主。免疫接種依然是防治該類傳染病的重要措施之一，目前使用的疫苗為滅活疫苗，還存在一些不足：①滅活疫苗的免疫保護(hù)效力十分有限，且不能激發(fā)保護(hù)性細(xì)胞免疫應(yīng)答；②羊支原體肺炎病原種類多樣，目前的疫苗主要以Mmc生產(chǎn)，但Mo和Mmc之間無交叉免疫保護(hù)，滅活疫苗存在生產(chǎn)周期長，生產(chǎn)成本高等因素。因此，新型疫苗的開發(fā)顯得十分迫切和必要。

羊肺炎支原體主要通過呼吸道等粘膜途徑侵入山羊機(jī)體內(nèi)，也可通過受傷的皮膚侵入，引起傳染性胸膜肺炎、關(guān)節(jié)炎、乳腺炎以及結(jié)膜炎等表現(xiàn)。可見，阻止羊支原體從呼吸道粘膜侵入山羊機(jī)體內(nèi)，誘發(fā)呼吸道等粘膜內(nèi)相關(guān)淋巴組織的免疫應(yīng)答應(yīng)是羊肺炎支原體新型疫苗的研究關(guān)鍵或重點(diǎn)之一，而這正是粘膜免疫疫苗-DNA疫苗的優(yōu)勢所在。

相關(guān)研究資料認(rèn)為，DNA疫苗抗原對(duì)黏膜免疫系統(tǒng)有效刺激是產(chǎn)生免疫效果的必要條件，而對(duì)黏膜免疫系統(tǒng)產(chǎn)生有效刺激需要兩個(gè)條件，一是DNA 疫苗抗原能夠有效投遞到黏膜免疫系統(tǒng)；二是需要合適的黏膜佐劑。目前，已報(bào)道的粘膜免疫佐劑主要可分為三類：第一類是細(xì)菌性物質(zhì)，包括蛋白(主要是細(xì)菌毒素)和核酸；第二類是各種細(xì)胞因子；第三類是抗原遞送系統(tǒng)。而在 DNA疫苗研究過程中使用廣泛的應(yīng)數(shù)第一類中CpG ODN序列(CpG)、霍亂毒素B亞單位(CTB)和大腸桿菌不耐熱腸毒素B亞單位(LTB)，且免疫佐劑效果明顯。本發(fā)明針對(duì)DNA疫苗免疫效果不盡理想問題，提出含佐劑基因的羊支原體肺炎二價(jià)核酸疫苗的構(gòu)建方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供含佐劑基因的羊支原體肺炎二價(jià)核酸疫苗的構(gòu)建方法，通過選擇兩個(gè)不同抗原基因和黏膜免疫佐劑基因研制出核酸疫苗，可有效針對(duì)羊支原體肺炎DNA疫苗免疫效果弱等問題，解決目前疫苗研發(fā)所面臨的諸多問題。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：含佐劑基因的羊支原體肺炎二價(jià)核酸疫苗的構(gòu)建方法，具體步驟如下：

步驟一、Mo/Mmc基因組的提取：

S1、Mo/Mmc貴州株的復(fù)蘇與培養(yǎng)：

在超凈工作臺(tái)中使用酒精棉球擦拭保存Mo貴州株和Mmc貴州株的單管式冷凍管表面，用剪刀打開管口，加入改良Hayflick's培養(yǎng)基溶解凍干菌種，將溶液接種于5mLHayflick's培養(yǎng)基，37℃恒溫震蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～5d，當(dāng)培養(yǎng)基顏色變?yōu)辄S色時(shí)取200μL進(jìn)行傳代，連續(xù)傳3代，并把每代培養(yǎng)物4℃保存?zhèn)溆茫?/p>

S2、Mo/Mmc貴州株DNA的提取：