[發明專利]含佐劑基因的羊支原體肺炎二價核酸疫苗的構建方法

在審

• 申請號: 202110693336.0
• 申請日: 2021-06-22
• 公開（公告）號: CN113444743A
• 公開（公告）日: 2021-09-28
• 發明（設計）人: 程振濤;楊鵬;張雙翔;岳筠;吳燕;袁林
• 申請（專利權）人: 貴州大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/66;C12N15/64;C12N15/62;A61K39/02;A61K39/39;A61P11/00;A61P31/04;C12R1/35
• 代理公司: 合肥華利知識產權代理事務所(普通合伙) 34170
• 代理人: 蔣玉嬌

1.含佐劑基因的羊支原體肺炎二價核酸疫苗的構建方法，其特征在于：具體步驟如下：

步驟一、Mo/Mmc基因組的提取：

S1、Mo/Mmc貴州株的復蘇與培養：

在超凈工作臺中使用酒精棉球擦拭保存Mo貴州株和Mmc貴州株的單管式冷凍管表面，用剪刀打開管口，加入改良Hayflick's培養基溶解凍干菌種，將溶液接種于5mLHayflick's培養基，37℃恒溫震蕩培養箱培養3～5d，當培養基顏色變為黃色時取200μL進行傳代，連續傳3代，并把每代培養物4℃保存備用；

S2、Mo/Mmc貴州株DNA的提取：

取第3代培養產物參照支原體基因組DNA提取試劑盒提取獲得Mo、Mmc的總DNA，并運用核酸蛋白測定儀測定核酸濃度；

步驟二、P113-LppA-IL-2融合基因擴增：

S1、粘膜免疫佐劑基因、綿羊肺炎支原體和絲狀支原體山羊亞種抗原基因擴增：

材料：pMD19-T-IL-2克隆質粒、綿羊肺炎支原體貴州分離株、絲狀支原體山羊亞種貴州分離株，2×Taq PCR MasterMix、DL2000 DNA Marker；

方法具體為：參考GenBank數據庫Mo GZ-QX1株的P113基因序列和Mmc PG3株的LppA基因序列信息及山羊IL-2基因序列，結合真核表達載體pVAX1多克隆位點，應用軟件各設計一對特異性引物，P113基因上游選用HindⅢ作為酶切位點、IL-2基因下游選用XhoⅠ作為酶切位點，根據特異性引物，運用PCR技術依次擴增P113、LppA和IL-2基因；

S2、P113-LppA融合基因擴增：

材料：2×Taq PCR MasterMix、DL2000 DNA Marker；

方法具體為：以P113基因和LppA基因PCR產物為模板，P113-F、LppA-R為引物，SOE-PCR技術擴增P113-LppA融合基因；

S3、P113-LppA-IL-2融合基因擴增：

材料：2×Taq PCR MasterMix、DL2000 DNA Marker；

方法具體為：以P113-LppA融合基因和IL-2基因PCR產物為模板，P113-F、IL-2-R為引物，SOE-PCR技術擴增P113-LppA-IL-2融合基因；

步驟三、含粘膜免疫佐劑基因的羊支原體肺炎二價核酸疫苗的制備：

S1、pVAX1-P113-LppA-IL-2真核表達載體的構建：

材料：真核表達載體pVAX1、大腸桿菌感受態細胞DH5α、2×Taq PCR MasterMix、限制性內切酶、DL2000 DNA Marker、DL5000 DNA Marker；

方法具體為：

1、目的基因雙酶切：應用限制性內切酶HindⅢ和XhoⅠ對目的基因P113-LppA-IL-2膠回收產物進行雙酶切；

2、pVAX1載體雙酶切：應用限制性內切酶HindⅢ和XhoⅠ對表達載體pVAX1進行雙酶切；

3、連接：將純化目的基因P113-LppA-IL-2與pVAX1載體運用快速連接試劑盒連接，建立20μL連接體系，22℃連接1h獲得連接產物；

4、轉化：取大腸桿菌感受態細胞DH5α置于冰上，向感受態細胞中加入20μL連接產物，輕輕混勻后冰浴30min，42℃水浴中熱沖擊90s，熱沖擊后迅速置于冰上作用3～5min，加入LB液體培養基至總體積1mL，混勻后37℃振蕩培養1h，使細菌恢復正常生長狀態，并表達質粒編碼的抗生素抗性基因(Kan+)，將菌液4℃5000r/min離心5min，棄去800μL上清，用剩余液體懸浮沉淀，取200μL涂布于含有Kan+的LB平板上，正面放置待完全吸收后倒置培養皿，于37℃恒溫箱培養16～24h后，進行陽性克隆挑選；

S2、pVAX1-P113-LppA-IL-2陽性重組質粒篩選：

材料：質粒提取試劑盒、2×Taq PCR MasterMix、限制性內切酶、DL2000 DNA Marker、DL5000 DNA Marker；

方法具體為：

1、重組質粒提取：挑取單個菌落，接種于5mL含有Kan+的LB液體培養基中，37℃恒溫振蕩培養過夜，使用E.Z.N.A.^TM Plasmid Kit質粒提取試劑盒提取重組菌的質粒DNA；

2、重組質粒PCR鑒定：以重組質粒DNA作為模板建立25μL反應體系；

3、重組質粒pVAX1-P113-LppA-IL-2雙酶切鑒定：應用限制性內切酶HindⅢ和XhoI對重組質粒DNA進行雙酶切；

S3、pVAX1-P113-LppA-IL-2重組質粒的體外表達鑒定：

材料：MDBK細胞、P113-LppA-IL-2融合蛋白兔源陽性血清、標準胎牛血清、胰蛋白酶、雙抗、脂質體、MEM基礎培養基、無內毒素質粒提取試劑盒、羊抗兔IgG-FITC、RNA提取試劑盒、2×Taq PCR MasterMix、DL2000 DNA Marker；

方法具體為：

1、無內毒素質粒的提取：按無內毒素質粒提取試劑盒說明書進行質粒提取備用；

2、轉染MDBK細胞：應用Lipofecttamine^TM3000轉染試劑，將制備好的重組質粒質粒導入MDBK細胞，同時設立未轉染的正常細胞對照和空載體對照

3、MDBK細胞培養MDBK細胞于37℃，5％CO₂環境下用含10％胎牛血清、1～2％雙抗的MEM培養液培養，使其轉染前在6孔細胞培養板中貼壁生長至70～80％；

4、脂質體3000轉染；

5、體外表達鑒定：轉染48h后，應用RNA提取試劑盒分別提取重組質粒組、空載體pVAX1組和空白對照組轉染細胞總RNA，按照一步法試劑盒的方法進行RT-PCR擴增及瓊脂糖凝膠電泳檢測，轉染48h后取細胞飛片，以P113-LppA融合蛋白兔源陽性血清為一抗，FITC標記的羊抗兔IgG為二抗，對重組質粒pVAX1-P113-LppA-IL-2、空載體pVAX1以及空白對照轉染MDBK細胞進行間接免疫熒光檢測。