[發明專利]一種哌尼生素前體、表達盒及其制備方法

有效

• 申請號: 202110688531.4
• 申請日: 2021-06-21
• 公開（公告）號: CN113354718B
• 公開（公告）日: 2023-06-02
• 發明（設計）人: 蘇國旗;黃升;陳利;江山;周曉容;楊飛云;黃金秀
• 申請（專利權）人: 重慶市畜牧科學院
• 主分類號: C07K14/195
• 分類號: C07K14/195;C12N15/75;C12N1/21;C12R1/125
• 代理公司: 重慶弘旭專利代理有限責任公司 50209
• 代理人: 文巍

本發明提供了一種哌尼生素前體、表達盒用于高效表達哌尼生素，所述前體為蛋白簇包括核心肽penA1、penB蛋白、penT蛋白、penC蛋白和penD蛋白，并提供了用于編碼上述哌尼生素前體的表達盒，從5’端到3’端核心肽編碼基因penA1、penB蛋白編碼基因penB、penT蛋白編碼基因penT、penC蛋白編碼基因penC、penD蛋白編碼基因penD依次串聯排列。本發明獲得的哌尼生素，活性好，生物穩定性強，對熱、胃液腸液等具有很好的耐受性，抑菌效果顯著，而且表達量高，培養成本低、生產周期短、易于產業化。

技術領域

本發明涉及一種哌尼生素及其制備方法，屬于生物技術領域。

技術背景

細菌素是細菌在代謝過程中通過核糖體合成的一類具有抑菌活性的多肽或前體多肽，有著理想的益生菌特性，其具備有效抑制病原體、調節炎癥、促進傷口愈合和粘膜防御等功能，且不產生任何副作用的特點。哌尼生素(Penisin)由Paenibacillus?sp?A3產生，屬于翻譯后修飾多肽lantibiotics，由44個氨基酸殘基組成(序列為：NFGLYTSQCYSSQCYSSKCYSDSCYSSDCYTGRHMCGYTHGYSC)，分子量4594.5Da，pH2-12穩定、耐受胰蛋白酶和蛋白酶K，對大腸桿菌、惡臭假單胞菌、金黃色葡萄球菌、李斯特氏菌的MIC小于10μg/ml，濃度為92μg/ml時溶血性同PBS相當、對哺乳動物細胞無毒性，80mg/kg體重用量時能顯著降低小鼠大腿感染模型(金黃色葡萄球菌MTCC96)的細菌載量(Baindara等，2016)，具有開發成飼用抗生素替代品的潛力。

哌尼生素通常由野生型Paenibacillus?sp?A3分泌，但是哌尼生素受到培養方式、培養基成分的影響，其分泌量很少，而且培養成本高。目前尚未有優化或者人工改造哌尼生素的生產菌株。

因此本專利利用枯草芽孢桿菌SCK168為表達宿主菌，將哌尼生素的基因簇基因penA1BTCD構建成表達盒，成功實現哌尼生素在枯草芽孢桿菌高效分泌表達，提高哌尼生素的產量，降低生產成本。

發明內容

本發明的目的在于提供一種哌尼生素(penisin)高效表達的前體、表達盒、方法用于生產和制備哌尼生素，為飼料添加劑、獸藥、食品及醫藥提供一種廉價的生物抗菌劑和防腐劑。

本發明的目的是通過以下措施實現的：

一種哌尼生素前體，包括核心肽penA1、penB蛋白、penT蛋白、penC蛋白和penD蛋白。

優選的，上述分泌型哌尼生素前體中核心肽penA1氨基酸序列為SEQ?ID?NO.2。SEQID?NO.2為核心肽或者不成熟肽，經過前體中其他功能蛋白加工修飾后切除N端20個氨基酸，形成只有44個氨基酸的成熟肽。

一種哌尼生素的表達盒，用于編碼上述哌尼生素前體。具體的，從5’端到3’端核心肽編碼基因penA1、penB蛋白編碼基因penB、penT蛋白編碼基因penT、penC蛋白編碼基因penC、penD蛋白編碼基因penD以依次串聯排列。

上述哌尼生素的表達盒，包括啟動子，啟動子的3’端連接核心肽編碼基因penA1。

上述分泌型哌尼生素的表達盒，核心肽penA1編碼基因、penB蛋白編碼基因、penT蛋白編碼基因、penC蛋白編碼基因、penD蛋白編碼基因的串聯位置有核糖體結合位點。

上述分泌型哌尼生素的表達盒，所述啟動子為P43啟動子。

上述哌尼生素的表達盒，采用三段克隆片段，片段1為penA1編碼基因，片段2為penB蛋白編碼基因和penT蛋白編碼基因，片段3為penC蛋白編碼基因和penD蛋白編碼基因。