[發明專利]一種利用SSR分子標記法鑒定青稞品種的方法及其用途

有效

• 申請號: 202110685583.6
• 申請日: 2021-06-21
• 公開（公告）號: CN113355444B
• 公開（公告）日: 2022-06-24
• 發明（設計）人: 姚曉華;吳昆侖;姚有華;安立昆;白羿雄
• 申請（專利權）人: 青海大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 成都華風專利事務所(普通合伙) 51223
• 代理人: 杜朗宇

1. 一種SSR引物，其特征在于，所述SSR引物由Seq ID No.3和Seq ID No.4，Seq IDNo.7和Seq ID No.8，Seq ID No.11和Seq ID No.12，Seq ID No.25和Seq ID No.26，SeqID No.29和Seq ID No.30，和Seq ID No.33和Seq ID No.34所示的序列組成。

2.一種利用SSR分子標記法鑒定青稞品種的方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）提取青稞品種樣品的DNA；

（2）用權利要求1所述SSR引物進行PCR擴增、變性聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染、毛細管電泳；

所述樣品選自青稞籽粒、胚、胚芽、幼苗、葉片中的一種或幾種；

所述青稞品種為甘青7號、甘青6號、甘青5號、黃青2號、甘青4號、阿青6號、阿青5號、藏青13號、昆侖14號、巖石稞、藏青690、昆侖15號、藏青320、喜馬拉雅19號、云稞1號、龍稞4號、康青8號、喜馬拉雅22號、康青9號、肚里黃、龍稞5號、藏青2000、甘青2號或云稞4號。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述PCR擴增的反應程序為：

94℃預變性4.5~5.5min；94℃變性25~35s，50~65℃退火55~65s，72℃延伸25~35s，10~15個循環，每循環降0.5~1.2℃；94℃變性25~35s，50℃退火40~50s，72℃延伸25~35s，20~25個循環；72℃延伸9~12 min。

4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述變性聚丙烯酰胺凝膠電泳的具體步驟包括：

(a)取6％變性聚丙烯酰胺溶液、四甲基乙二胺、10％過硫酸胺，混勻，制膠；

(b) 將PCR擴增產物與加樣緩沖液混勻，變性后冷卻，進行電泳。

5.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述變性的條件為92~98℃變性4.5~5.5min；

所述電泳的條件為恒定功率60~80W，電泳時間1.5~2.5h；

所述電泳時，凝膠的溫度為45~55℃。

6.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述銀染的步驟包括：將凝膠固定后水洗，銀染15~20min后再水洗，顯色至條帶清晰后定影；

所述固定的條件為20~35 rpm固定15~25 min；

所述水洗的時間≤10s/次；所述定影時間為4.5~5.5min。

7.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述毛細管電泳的具體步驟包括：取等體積同一組合引物的不同熒光標記的擴增產物，混勻，得到混合液，吸取混合液、分子量內標和去離子甲酰胺加入到96孔板上，變性、冷卻、離心，電泳；

所述內標的用量為0.05~0.15μL；

所述去離子甲酰胺的用量為8~9.5μL；

所述變性的條件為90~100 ℃，3~7min。

8.權利要求1所述引物在青稞品種鑒定中的用途；

所述青稞品種為甘青7號、甘青6號、甘青5號、黃青2號、甘青4號、阿青6號、阿青5號、藏青13號、昆侖14號、巖石稞、藏青690、昆侖15號、藏青320、喜馬拉雅19號、云稞1號、龍稞4號、康青8號、喜馬拉雅22號、康青9號、肚里黃、龍稞5號、藏青2000、甘青2號或云稞4號。

9.權利要求1所述引物在青稞品種的遺傳親緣關系的分析中的用途；

所述青稞品種為甘青7號、甘青6號、甘青5號、黃青2號、甘青4號、阿青6號、阿青5號、藏青13號、昆侖14號、巖石稞、藏青690、昆侖15號、藏青320、喜馬拉雅19號、云稞1號、龍稞4號、康青8號、喜馬拉雅22號、康青9號、肚里黃、龍稞5號、藏青2000、甘青2號或云稞4號。