[發明專利]一種一步法構建DNA納米球的試劑盒和方法

有效

• 申請號: 202110685550.1
• 申請日: 2021-06-21
• 公開（公告）號: CN113249457B
• 公開（公告）日: 2021-10-29
• 發明（設計）人: 謝珍;曾志鵬;張鵬;邢寬
• 申請（專利權）人: 南京實踐醫學檢驗有限公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869
• 代理公司: 南京瑞華騰知識產權代理事務所(普通合伙) 32368
• 代理人: 邱歡歡

本發明公開了一種一步法構建DNA納米球的試劑盒和方法，該試劑盒包括R1、R2和R3，R1包括DNB制備緩沖液，R2包括DNB聚合酶緩沖液、DNB聚合酶混合液，R3包括DNB終止緩沖液。該方法包括dsDNA文庫與DNB制備緩沖液混勻后高溫變性及低溫退火；退火產物與DNB聚合酶緩沖液、DNB聚合酶混合液混勻，低溫下反應；DNB終止緩沖液終止反應。該試劑盒和方法創造性地將單鏈環化和滾環擴增過程放在一個步驟進行反應，且中間不用酶切消化和純化，大大節省了操作步驟和時間。

技術領域

本發明屬于高通量測序技術領域，具體涉及一種一步法構建DNA納米球的試劑盒和方法。

背景技術

近年來快速發展的NGS技術因其不依賴于已知核酸序列，無需特殊探針設計，可直接對未知病原微生物進行檢測，打破了傳統微生物檢驗的局限性，在臨床微生物領域展現了廣闊的前景。

目前，全球感染性疾病的發病率有所上升，病原微生物呈現多樣化和復雜化的發展趨勢。重癥急性呼吸綜合征(SARS)、新型冠狀病毒肺炎、新變異型克雅病、H7N9禽流感等新發感染性疾病不斷出現。而HIV、多重或廣譜耐藥的結核分枝桿菌、沙眼支原體等經典感染性疾病病原微生物又死灰復燃或出現新的致病特征。各種新發和再發的感染性疾病、不易發現的多重感染以及不明病因的發熱等，都給人類健康帶來了巨大的威脅，因此，臨床上對感染性疾病診斷的準確性和時效性提出了更高的要求。

隨著高通量測序在臨床應用的輔助診斷重要性的提升，如何降低測序成本是一個很關鍵的問題。華大智造(MGI)不斷推出更高測序通量的測序儀，測序成本不斷降低，相繼推出MGI-200、MGI-2000和T7測序儀，其中T7測序儀是目前市場上測序通量最高和測序成本最低的測序儀，使得華大智造的測序儀在市場上的應用越來越多。

MGI平臺在上機測序之前需要進行DNA納米球（DNANanoball，DNB）的制備。目前，制備DNA納米球的流程（如圖1）是先把dsDNA文庫進行單鏈環化、酶切消化、磁珠純化、變性退火、滾環擴增等過程，整個操作需要2小時以上，整個操作流程多、時間長。

鑒于臨床上對時效性的迫切需求，因此，仍需要對現有技術進行改進，以改善現有流程多、時間長的問題。

發明內容

本發明的目的在于提供一種一步法構建DNA納米球的試劑盒和方法，使得整個DNB制備的過程從2小時降低到0.5小時，大大地縮短了上機前的操作時間。

為實現上述目的，本發明的一個方面是提供一種一步法構建DNA納米球的試劑盒，包括試劑R1、R2和R3，

所述R1包括DNB制備緩沖液；

所述R2包括DNB聚合酶緩沖液、DNB聚合酶混合液；

所述R3包括DNB終止緩沖液。

本發明的DNB制備緩沖液包括50-80mM乙酸鉀、10-20mM乙酸鎂、20-50mMTris-乙酸、0.1-0.3mg/mlBSA、1-10mMDTT、1-5μM寡聚核苷酸1、1-5μM寡聚核苷酸2、0.01-1μM寡聚核苷酸3、1-5μM寡聚核苷酸4。

優選的是，所述寡聚核苷酸1其序列如SEQIDNO.1所示：5′-GCCATGTCGTTCTGTGAGCCAAGG-3′；所述寡聚核苷酸2其序列如SEQIDNO.2所示：5′-GAACGACATGGCTACGATCCGACTT-3′；所述寡聚核苷酸3其序列如SEQIDNO.3所示：5′-AAGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGAAGACAA-3′；所述寡聚核苷酸4其序列如SEQIDNO.4所示：5′-CAACTCCTTGGCTCACA-3′。

更優選的是，所述四個寡聚核苷酸的3′端最后兩個核苷酸之間的連接鍵進行硫代磷酸化修飾。