[發明專利]一種一步法構建DNA納米球的試劑盒和方法

有效

• 申請號: 202110685550.1
• 申請日: 2021-06-21
• 公開（公告）號: CN113249457B
• 公開（公告）日: 2021-10-29
• 發明（設計）人: 謝珍;曾志鵬;張鵬;邢寬
• 申請（專利權）人: 南京實踐醫學檢驗有限公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869
• 代理公司: 南京瑞華騰知識產權代理事務所(普通合伙) 32368
• 代理人: 邱歡歡

1.一種一步法構建DNA納米球的試劑盒，其特征在于：由R1、R2和R3組成，其中，

R1為DNB制備緩沖液；

R2為DNB聚合酶緩沖液、DNB聚合酶混合液；

R3為DNB終止緩沖液；

所述DNB制備緩沖液為50-80mM乙酸鉀、10-20mM乙酸鎂、20-50mM Tris-乙酸、0.1-0.3mg/ml BSA、1-10mM DTT、1-5μM寡聚核苷酸1、1-5μM寡聚核苷酸2、0.01-1μM寡聚核苷酸3、1-5μM寡聚核苷酸4；

所述DNB聚合酶緩沖液為1-10mM乙酸鉀、5-20mM乙酸鎂、10-40mM Tris-乙酸、0.1-0.3mg/ml BSA、1-5mM DTT、1-5mM ATP和1-5mM dNTP；

所述DNB聚合酶混合液為phi29 DNA Polymerase、T4 DNA Ligase、焦磷酸酶和單鏈結合蛋白；

其中，所述單鏈結合蛋白為T4 Gene32 Protein、E.coli SSB；

所述DNB終止緩沖液為EDTA，其濃度為100mM-500mM；

所述寡聚核苷酸1其序列如SEQ ID NO.1所示：5′-GCCATGTCGTTCTGTGAGCCAAGG-3′；所述寡聚核苷酸2其序列如SEQ ID NO.2所示：5′-GAACGACATGGCTACGATCCGACTT-3′；所述寡聚核苷酸3其序列如SEQ ID NO.3所示：5′-AAGTCGGAGGCCAAGCGGTCTTAGGAAGACAA-3′；所述寡聚核苷酸4其序列如SEQ ID NO.4所示：5′-CAACTCCTTGGCTCACA-3′；

其中，四個寡聚核苷酸的3′端最后兩個核苷酸之間的連接鍵進行硫代磷酸化修飾；

所述DNA納米球的構建方法，包括以下步驟：

（1）將構建好的dsDNA文庫與所述DNB制備緩沖液充分混勻；

（2）經過高溫變性及低溫退火后，寡聚核苷酸結合在ssDNA文庫上；

（3）退火產物與所述DNB聚合酶緩沖液、DNB聚合酶混合液輕輕吹打混勻；在低溫下，ssDNA同時發生環化和滾環擴增；

（4）滾環擴增產物用DNB終止緩沖液終止，即得到測序用DNA納米球；

所述Phi29 DNA Polymerase的工作濃度為0.1-1U/μl，T4 DNA Ligase的工作濃度為0.1-0.5U/μl，焦磷酸酶的工作濃度為5-50ng/μl，T4 Gene32 Protein的工作濃度為0.1-0.5U/ml，E.coli SSB的工作濃度為0.1-0.5U/ml。

2.根據權利要求1所述的一種一步法構建DNA納米球的試劑盒，其特征在于：所述高溫變性的溫度為95℃-99℃，所述低溫退火的溫度為20℃-40℃。