[發明專利]一種快速檢測SARS-CoV-2病毒中和抗體有效性的方法

在審

• 申請號: 202110684183.3
• 申請日: 2021-06-21
• 公開（公告）號: CN115572714A
• 公開（公告）日: 2023-01-06
• 發明（設計）人: 王潔;秦松柏;張華
• 申請（專利權）人: 江蘇澤凱生物醫藥技術有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/85;C12N15/50;C07K14/165;G01N33/68;G01N33/569
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

本發明公開了一種穩定表達SARS?CoV?2病毒結構蛋白M、N、E的細胞株，將SARS?CoV?2?S質粒和Ha?CoV?2?Luc質粒共轉染可以生產SARS?CoV?2病毒樣顆粒，進一步用于SARS?CoV?2病毒中和抗體有效性檢測。使用本發明構建的穩定表達SARS?CoV?2蛋白(M、N、E)的細胞株，可快速有效產出大量具有全部SARS?CoV?2結構蛋白(M、N、E、S)的病毒樣顆粒。該病毒樣顆粒不僅與SARS?CoV?2更為相似，而且安全性可控，具有熒光表達基因，可在幾個小時內實現準確快速的SARS?CoV?2中和抗體有效性檢測，對有效應對SARS?CoV?2病毒具有重要意義。

技術領域

本發明涉及一種快速檢測SARS-CoV-2病毒中和抗體有效性的方法，屬于基因工程技術領域。

背景技術

SARS-CoV-2是一類具有囊膜、線性單股正鏈的RNA病毒，具有5個必需基因，分別編碼翻譯核蛋白(N)、病毒包膜(E)、基質蛋白(M)和刺突蛋白(S)4種結構蛋白以及 RNA依賴性的RNA聚合酶(RdRp)。由于具有高致病性呼吸道病毒，感染性極強的特性。針對SARS-CoV-2株的工作必須在具有至少BSL3級別的環境下進行。

新型冠狀病毒中和抗體和疫苗作為防治新冠的主要手段，今天正被廣泛的研發與投產使用，但由于人群基數大，病毒株的變異多，新冠抗體及疫苗對人群的有效性有明顯的個體差異，因此針對新冠中和抗體的有效性檢測對防治新冠尤為重要。

目前，基于SARS-CoV-2的安全性要求，兩種主要技術被用于對新冠中和抗體有效性的大規模檢測。第一種檢測技術基于ACE-2/S蛋白，即使用酶聯免疫吸附法(ELISA)或膠體金平臺檢測中和抗體對新冠抗原蛋白的結合效率；第二種檢測技術基于假病毒，即使用在復制缺陷型病毒的表面上表達SARS-CoV-2S蛋白的嵌合性病毒顆粒代替SARS-CoV-2，通過檢測相應信號，評估中和抗體抑制病毒復制的效率。

基于ACE-2/S蛋白的檢測技術用時短(0.5-2小時)，但由于僅針對特定抗原蛋白的結合，因此評估準確性低；基于假病毒的檢測技術準確率高，但用時長(2-3天)，同時由于所使用的假病毒顆粒只表達SARS-CoV-2的部分蛋白，因此存在潛在的評估結果差異性。

發明內容

針對現有基于ACE-2/S蛋白的檢測技術、基于假病毒的檢測技術存在的準確性低與檢測用時長的缺點，本發明構建了一種穩定表達SARS-CoV-2病毒蛋白(M、N、E)的細胞株，可快速有效產出大量具有全部SARS-CoV-2結構蛋白(M、N、E、S)的病毒樣顆粒，該病毒樣顆粒不僅與SARS-CoV-2更為相似，而且安全性可控，同時該病毒樣顆粒具有熒光表達基因，可更準確快速的進行中和抗體有效性檢測。

本發明提供的穩定表達SARS-CoV-2病毒結構蛋白(M、N、E)的細胞株，通過使用攜帶有SARS-CoV-2病毒M、N、E蛋白基因的VSV-G假病毒轉染細胞，利用抗性篩選標記獲得單克隆細胞。

在一種實施方式中，所述細胞為239T細胞。

在一種實施方式中，所述VSV-G假病毒的包裝方法如下：將pHAGE2-EF1aInt-M-N-E- IRES-G418質粒,pCMVΔR8.2質粒,pCMV-VSV-G質粒共轉染293T細胞，獲得VSV-G假病毒。

在一種實施方式中，所述抗性篩選標記為G418。

本發明還提供了一種生產SARS-CoV-2病毒樣顆粒的方法，通過將SARS-CoV-2-S質粒和Ha-CoV-2-Luc質粒共轉染穩定表達SARS-CoV-2病毒結構蛋白(M、N、E)的細胞株，培育后收集上清濃縮保存。

在一種實施方式中，所述穩定表達SARS-CoV-2病毒結構蛋白的細胞株，通過攜帶有 SARS-CoV-2病毒M、N、E結構基因的VSV-G假病毒轉染細胞，使用抗性篩選標記獲得。