[發明專利]一種基于凝膠電泳法評估口蹄疫疫苗中有效抗原含量及純度的方法

在審

• 申請號: 202110683103.2
• 申請日: 2021-06-19
• 公開（公告）號: CN113311052A
• 公開（公告）日: 2021-08-27
• 發明（設計）人: 郭振華;邢廣旭;孫亞寧;楊蘇珍;陳鑫鑫;李睿;郭軍慶;喬松林
• 申請（專利權）人: 河南省農業科學院動物免疫學重點實驗室
• 主分類號: G01N27/447
• 分類號: G01N27/447
• 代理公司: 鄭州市華翔專利代理事務所(普通合伙) 41122
• 代理人: 張愛軍

本發明涉及一種基于凝膠電泳法評估口蹄疫疫苗中有效抗原含量及純度的方法，以146S抗原的主要組成成分VP1、VP2和VP3為評價對象，開發出一種操作簡單、重復性好、快速、準確，在多數實驗室均可以實施的口蹄疫滅活疫苗有效抗原含量的評價方法。該評價方法所用設備在普通實驗室一般均有配置，從根本上破除了對昂貴儀器設備，如超高速離心機、液相色譜儀和毛細管電泳儀的依賴；同時，所用到的試劑為常用試劑，均可以購買到商品化的產品，保證了該方法在不同實驗室實施時均具有良好的重復性。與現有方法相比，由于不需要制備標準抗原及多克隆抗體的血清，極大縮短了整個評價的時間，通常可以在6?8小時內完成目的疫苗的評價。

技術領域

本發明涉及一種基于凝膠電泳法評估口蹄疫疫苗中有效抗原含量及純度的方法，屬于分子檢測技術領域。

背景技術

口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)是由口蹄疫病毒(FMD virus，FMDV)感染引起的一種急性、烈性傳染病，主要發病動物為豬、牛、羊等偶蹄動物，易感動物多達70余種。該病傳播速度極快，發病后會嚴重影響動物的生產性能，同時也嚴重制約了動物和畜產品的正常國際貿易，世界動物衛生組織將其列為A類動物疫病，我國將其劃為一類動物傳染病。

FMDV屬于小RNA病毒科，口蹄疫病毒屬，病毒粒子無囊膜，主要由結構蛋白VP1、VP2、VP3和VP4組成，其中VP1、VP2和VP3位于病毒粒子表面，VP4位于病毒衣殼的內部。VP1蛋白由213～221個氨基酸組成，與病毒吸附、入侵、保護性免疫應答和血清特異性有關。VP2由219個氨基酸組成在病毒粒子穩定和成熟過程中起主要作用。VP3由219～221個氨基酸組成，主要維持衣殼穩定，具有重要的構象性表位。VP4大約由70個氨基酸組成，具有增強內涵體膜通透性，釋放病毒RNA的功能。因此，結構蛋白負責組裝病毒衣殼，決定抗原特異性，是病毒最重要的抗原成份。純化的病毒粒子經裂解后，通過SDS-PAGE和考馬斯亮藍染色，理想情況下可以清楚看到VP1-VP33個條帶，但多數情況下因為蛋白分子量的重疊，會在分子量為25-37KD區間內出現特異性的雙條帶。

我國采取以預防為主的綜合防控策略防控口蹄疫，對口蹄疫易感動物接種滅活疫苗是最常用的免疫措施，使用的滅活疫苗以雙向油乳劑疫苗為主。所述的滅活疫苗是口蹄疫田間毒株經病毒培養系統大量擴增、滅活，然后通過純化獲得高純度的病毒粒子，再和相應佐劑乳化復配而成，為控制我國口蹄疫的大流行起到了重要作用。滅活疫苗中的有效抗原含量及純度是關鍵性的技術指標之一，很大程度上決定了疫苗的效力。當前疫苗生產企業主要將146S的含量作為疫苗生產的質控指標之一，146S指的是通過蔗糖密度梯度離心法純化病毒粒子時對應的沉降系數。當前，已開發出了多種基于146S的疫苗質量評價體系，但在應用上均存在一定制約因素。

經檢索，申請號CN201510025994.7的文件公開一種口蹄疫疫苗抗原146S測定方法，需用到超高速離心機和高效液相色譜儀，這雖然可以提供準確的定量數據，但是用到的昂貴設備卻不是普通實驗室所能具備的，限制了該方法的應用。申請號為CN201510878606.X的文件公開一種確定口蹄疫疫苗組份及估計抗原含量的方法，同樣需要超高速離心機，并且需要制備針對146S抗原的兔多抗血清，操作時間長，且不易進行標準化。因此，提供一種便捷的口蹄疫疫苗有效抗原含量和純度的評價方法對于廣大養殖企業來說具有重要的臨床意義。

發明內容

針對現有技術的不足，本發明提供一種基于凝膠電泳法評估口蹄疫疫苗中有效抗原含量及純度的方法，以146S抗原的主要組成成分VP1、VP2和VP3為評價對象，開發出一種操作簡單、重復性好、快速、準確，在多數實驗室均可以實施的口蹄疫滅活疫苗有效抗原含量的評價方法。

為了實現上述目的，本發明所采用的技術方案是：

一種基于凝膠電泳法評估口蹄疫疫苗中有效抗原含量及純度的方法，包括以下步驟：

(1)待測口蹄疫疫苗的破乳及抗原相的分離