[發明專利]一種基于凝膠電泳法評估口蹄疫疫苗中有效抗原含量及純度的方法在審
| 申請號： | 202110683103.2 | 申請日： | 2021-06-19 |
| 公開（公告）號： | CN113311052A | 公開（公告）日： | 2021-08-27 |
| 發明（設計）人： | 郭振華;邢廣旭;孫亞寧;楊蘇珍;陳鑫鑫;李睿;郭軍慶;喬松林 | 申請（專利權）人： | 河南省農業科學院動物免疫學重點實驗室 |
| 主分類號： | G01N27/447 | 分類號： | G01N27/447 |
| 代理公司： | 鄭州市華翔專利代理事務所(普通合伙) 41122 | 代理人： | 張愛軍 |
| 地址： | 450000 河*** | 國省代碼： | 河南;41 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 基于 凝膠電泳 評估 口蹄疫 疫苗 有效 抗原 含量 純度 方法 | ||
1.一種基于凝膠電泳法評估口蹄疫疫苗中有效抗原含量及純度的方法，其特征在于，包括以下步驟：
(1)待測口蹄疫疫苗的破乳及抗原相的分離
在離心管中加入待測疫苗液和正丁醇，充分混勻后，在20-25℃條件下，于多功能試管旋轉搖床中以30轉/分的速度破乳1h；之后在4℃下靜置1h，此時液體分為上、中、下三層，下層水相即為分離出的抗原相，移入新的離心管，備用；
(2)抗原相的濃縮
取步驟(1)獲得的抗原相吸取4mL，加入Amicon Ultra-10K的蛋白濃縮管中，在4℃下以5000g的離心力進行離心，待體積濃縮為400μL后停止離心；用磷酸鹽緩沖液調整濃縮樣品的體積為0.5mL，得到濃縮抗原液，于-40℃或-80℃保存，備用；
(3)蛋白樣品的制備
取步驟(2)獲得的濃縮抗原液80μL，加入離心管中，然后加入20μL SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5x)，于100℃下加熱5min，得到蛋白樣品，備用；
(4)SDS-PAGE電泳分析
對步驟(3)制備的蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳分析，其中變性蛋白預制膠的質量分數為12％或15％，蛋白樣品的上樣量為20μL，蛋白Marker的分子量范圍為10-180KDa；得到蛋白膠，備用；
(5)考馬斯亮藍染色、脫色
將步驟(4)獲得的蛋白膠浸入考馬斯亮藍染色液染色0.5～1h，然后浸入考馬斯亮藍脫色液脫色1.5～2h，期間更換考馬斯亮藍脫色液2-3次；
(6)根據目的條帶情況判定待測口蹄疫疫苗有效抗原的含量及純度。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述待測疫苗液與正丁醇的體積比為9:1。
3.如權利要求1所述的方法，其特征在于，電泳的程序為：先以80V電壓電泳10～15min，待樣品進入分離膠后，再將電壓調至120V電泳40～60min，當溴酚藍指示劑達到蛋白膠的底部時，即停止電泳。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，1L考馬斯亮藍染色液的配方包括：甲醇，450mL；蒸餾水，450mL；冰乙酸，100mL；考馬斯亮藍，2.5g。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于，1L考馬斯亮藍脫色液的配方包括：乙醇，50mL；冰乙酸，100mL；蒸餾水，850mL。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，目的條帶中有效抗原組分VP1、VP2和VP3的分子量在25-37KDa之間，顯示為2條蛋白條帶；其它位置的條帶均為雜蛋白的條帶，為病毒增殖過程中所用細胞的蛋白組分。
7.如權利要求1-6任一項所述的方法在口蹄疫疫苗初步評價中的應用。
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