[發明專利]一種重組大腸桿菌固定化細胞及其應用

在審

• 申請號: 202110680783.2
• 申請日: 2021-06-19
• 公開（公告）號: CN113403245A
• 公開（公告）日: 2021-09-17
• 發明（設計）人: 朱云峰;苗華明;夏俊剛;孫劍峰;袁風嬌;張立志;李鶴松
• 申請（專利權）人: 迪嘉藥業集團有限公司;迪沙（濟南）藥物研究有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/56;C12N11/10;C12N11/084;C12R1/19
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明涉及一種重組大腸桿菌固定化細胞及在微分子透明質酸或其鹽制備上的應用。本發明的技術方案是一種含有透明質酸酶的重組大腸桿菌固定化細胞，先構建含有天然透明質酸酶編碼基因的重組質粒，然后導入大腸桿菌感受態細胞，經過篩選得到重組大腸桿菌，并對重組大腸桿菌進行固定化而得到該固定化細胞。本發明提供了一種重組大腸桿菌固定化細胞及在微分子透明質酸或其鹽制備上的應用。

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，具體而言，涉及一種重組大腸桿菌固定化細胞及在微分子透明質酸或其鹽制備上的應用。

背景技術

透明質酸是由N-乙酰氨基葡萄糖和D-葡萄糖醛酸組成的雙糖單位重復構成的無分支糖胺聚糖，存在于動物細胞間質和某些細菌莢膜中，在化妝品、食品、醫藥領域具有廣泛的應用。按照分子量大小，可將透明質酸或其鹽分為大分子（1800～3000 kDa）、中分子（1000～1800 kDa）、小分子（10～1000 kDa）、微分子（10 kDa以下），不同分子量的透明質酸具有不同的鎖水、滲透、生物活性功能。中、小分子量透明質酸有助于蛋白和多肽類物質的運輸，應用于慢性傷口愈合，微分子透明質酸可以滲透至皮膚基底層，有效抑制炎癥因子釋放，緩解各種因素引起的皮膚敏感狀態，清除自由基，修復紫外線或化學物質刺激造成的皮膚細胞損傷，實現深層保濕和修復受損細胞，還可以通過破壞受體和透明質酸的結合殺死許多種類的癌細胞。

隨著低分子透明質酸的應用推廣，其降解及制備技術成為研究的熱點。常見的降解方法有物理降解，如加熱、超聲破碎法、輻射等；化學降解，如氧化水解、酸水解、堿水解等，但是這兩種降解方法存在寡糖分子量分布范圍廣、純化程序復雜、寡糖結構易被破壞、對設備要求高等缺點，降低了特定分子量寡糖的制備效率，難以在工業規模大量生產。而生物酶法制備低分子透明質酸的反應條件溫和、制備效率較高。

專利CN 103255187 B公開了一種制備低分子透明質酸的方法，由保藏號為CGMCCNo.5744的芽孢桿菌發酵生產的透明質酸酶，對分子量大于1000 kDa的透明質酸或其鹽進行降解，每1 kg透明質酸或其鹽中加酶量10⁶～10⁷ IU，其制備步驟包括芽孢桿菌種子培養、芽孢桿菌發酵產酶、酶液提取、酶解、滅活、過濾、沉淀、脫水、干燥。

專利CN 109897876 B公開了一種小分子透明質酸或其鹽的制備方法，使用由菌種保藏號CGMCC No.16836的植物乳桿菌發酵生產的透明質酸酶，酶解分子量500 KDa～700KDa透明質酸或其鹽，每1 kg透明質酸或其鹽中加酶量10⁵～10⁸ IU，其制備步驟包括植物乳桿菌種子培養、發酵產酶、酶液提取、酶解、滅活、活性炭吸附除雜、過濾微孔濾膜、低溫噴霧干燥得到小分子透明質酸或其鹽。

專利CN 110331178 B公開了一種酶切法制備小分子透明質酸的方法，使用保藏號CCTCC NO：M 2018452的球形節桿菌HL6發酵生產的透明質酸酶，酶解分子量大于600 KDa透明質酸或其鹽，每1 kg透明質酸或其鹽中加酶量10⁵～5*10⁸ U，其制備步驟包括球形節桿菌種子培養、發酵產酶、酶液提取、酶解、滅活、過濾、沉淀、脫水、干燥。

專利CN 104263666 B公開了一種產小分子透明質酸的重組畢赤酵母及其構建方法，采用獸疫鏈球菌來源的透明質酸合酶has A和枯草芽孢桿菌來源的UDP-葡萄糖脫氫酶tuaD，在重組畢赤酵母宿主中實現透明質酸的生產，同時，采用水蛭來源的透明質酸酶整合至畢赤酵母基因組上，分別置于不同強度的組成型啟動子下分泌表達，通過控制透明質酸酶的分泌量來制備不同分子量大小的小分子透明質酸。以甘油、甲醇、山梨醇或葡萄糖為碳源，20～30℃下發酵48～96 h。