[發明專利]一種重組大腸桿菌固定化細胞及其應用

在審

• 申請號: 202110680783.2
• 申請日: 2021-06-19
• 公開（公告）號: CN113403245A
• 公開（公告）日: 2021-09-17
• 發明（設計）人: 朱云峰;苗華明;夏俊剛;孫劍峰;袁風嬌;張立志;李鶴松
• 申請（專利權）人: 迪嘉藥業集團有限公司;迪沙（濟南）藥物研究有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/56;C12N11/10;C12N11/084;C12R1/19
• 代理公司: 暫無信息
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1.一種含有透明質酸酶的重組大腸桿菌固定化細胞，其特征在于，先構建含有天然透明質酸酶編碼基因的重組質粒，然后導入大腸桿菌感受態細胞，經過篩選得到重組大腸桿菌，并對重組大腸桿菌進行固定化而得到該固定化細胞。

2.根據權利要求1所述透明質酸酶的重組大腸桿菌固定化細胞，其特征在于，基于易錯PCR技術的酶體外進化技術，以重組質粒pET28(a+)-PF為模板，使用易錯PCR技術，獲得含有堿基突變的線性基因片段，將PCR產物和pET28a(+)表達質粒分別進行雙酶切（EcoRI、NotI）、純化、連接和轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，然后進行PCR驗證和誘導表達，經過大量篩選獲得酶活單位明顯提高的突變株。

3.權利要求1所述透明質酸酶的重組大腸桿菌固定化細胞的制備方法如下，其特征在于，含有如下步驟：

第一步合成Penicilliumfuniculosum天然透明質酸酶編碼基因（GenBank:AB355480），通過EcoR I和Not I酶切位點連接至質粒pET28(a+)得到重組質粒pET28(a+)-PF；

第二步采用熱激轉化法（42 ℃處理90秒后冰浴5分鐘）將重組質粒pET28(a+)-PF轉化感受態大腸桿菌細胞E.coliDH5α，經過卡那霉素抗性篩選獲得含有透明質酸酶的重組大腸桿菌E.coliDH5α-pET28(a+)-PF；

第三步挑取E.coli DH5α-pET28(a+)-PF單菌落接入Luria-Bertani培養基（LB培養基），37℃，220 r/m活化培養15 h左右，應用質粒小量提取試劑盒提取重組質粒pET28(a+)-PF；

第四步采用熱激轉化法（42 ℃處理90秒后冰浴5分鐘）將重組質粒pET28(a+)-PF轉化大腸桿菌E.coliBL21(DE3)感受態細胞，經過卡那霉素抗性篩選獲得含有透明質酸酶的重組大腸桿菌E.coliBL21-pET28(a+)-PF；

第五步E.coli BL21-pET28(a+)-PF發酵培養，具體如下：

培養基制備：配制Luria-Bertani培養基（LB培養基），卡那霉素終濃度為50～100 mg/L；

種子培養：挑取重組大腸桿菌單菌落接種至步驟（一）培養基，37 ℃，220 r/m震蕩培養8～15 h；

發酵培養：以2～6 %接種量接種至步驟（一）培養基，37 ℃，220 r/m震蕩培養至發酵液在600 nm處吸光度值（OD₆₀₀）達到0.6～1.0；

誘導表達：加入終濃度為0.05～0.1 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG），18～25 ℃下誘導表達8～12 h；

后處理：首先，將發酵液在8000～12000 r/m離心10～20 min，棄掉上層清液；然后，將下層菌體用0.85 %氯化鈉溶液震蕩懸浮，8000～12000 r/m離心10～20 min一次，棄掉上層清液；接著，再用0.85 %氯化鈉溶液重復洗滌、離心一次；最后，用1/20～1/10原始發酵液體積的0.85%氯化鈉溶液懸浮菌體，得到濕菌體細胞；

第六步制備固定化細胞，具體如下：

制備固定化載體：分別稱取海藻酸鈉0.5～6 g，聚乙烯醇1～10 g，用100～150 mL熱水溶解，115℃滅菌20 min，冷卻至室溫；

制備固定化細胞：將第五步（五）得到的濕菌體細胞與上一步驟的固定化載體，按照1:1～1：10體積比充分混合，將該混合液逐滴加入0～4℃ 0.1～4 %氯化鈣和1～5 %硼酸溶液中進行固化，然后置于0～4℃下冷卻成型12～24 h，控制固定化顆粒粒度2～10 mm；

過濾洗滌：用200～300目篩網過濾固定化細胞，無菌水沖洗2～3次。

4.權利要求1所述透明質酸酶的重組大腸桿菌固定化細胞在制備微分子（5000-10000Da）透明質酸或其鹽中的應用，其特征在于，含有如下步驟：

第一步配制濃度為2～5%（m/V）的高分子量（1000 KDa～2000 KDa）透明質酸或其鹽溶液；

第二步加入10～30 %（m/V）比例的第六步所得固定化細胞，在30～40 ℃、100～150 r/m條件下反應4～10 h，反應完全后，將反應液用200～300目篩網過濾，分別得到微分子透明質酸或其鹽溶液和固定化細胞顆粒；

第三步用無菌0.85%氯化鈉溶液洗滌固定化細胞后，置于4℃冰箱保存，使用截留分子量為3 KDa的超濾膜濃縮低分子量透明質酸或其鹽溶液，然后將濃縮液進行減壓干燥，待水分＜5%后，粉碎、過100目篩得到微分子透明質酸鈉。