[發明專利]極地來源的彎孢聚殼屬真菌原生質體的制備方法

有效

• 申請號: 202110679651.8
• 申請日: 2021-06-18
• 公開（公告）號: CN113337406B
• 公開（公告）日: 2022-12-06
• 發明（設計）人: 盧小玲;寧耀東;胡波;于豪冰;劉小宇;孔杰;徐堯;焦炳華
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍海軍軍醫大學
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12R1/645
• 代理公司: 上海申浩律師事務所 31280
• 代理人: 趙青

本發明公開了極地來源的彎孢聚殼屬真菌原生質體的制備方法，包括(1)新鮮菌絲體制備：取活化培養了2?3代的菌絲體或菌株種子液接種至PDB液體培養基中搖瓶培養；(2)菌絲體收集：菌絲體液離心棄上清后使用0.65～0.85mol/L的滅菌滲透壓穩定劑清洗，得待用菌絲體；(3)酶解液的制備：配置裂解酶和崩潰酶混合液，加入滅菌滲透壓穩定劑充分溶解、過濾除菌后冷藏待用；(4)原生質體制備：將酶解液加入到(2)收集的菌絲體中，搖床下恒溫培養；(5)原生質體收集：將步驟(4)的混合液過濾，離心棄上清后使用滅菌滲透壓穩定劑清洗并重懸；(6)原生質體再生：將(5)中的原生質體懸液與再生培養基混合，倒平板凝固后于28℃培養箱中培養，觀察復蘇情況。

技術領域

本發明屬于真菌原生質體制備及再生技術領域，具體涉及一種極地來源的彎孢聚殼屬真菌Eutypella sp.D-1原生質體的制備方法。

背景技術

彎孢聚殼屬真菌Eutypella sp.D-1分離自北極地區，可以產生一系列結構獨特的次級代謝產物，比如倍半萜、海松烷二萜、細胞松弛素類和甾體類等化合物，其中大部分次級代謝產物都有較好的抗菌和抗腫瘤活性。前期，發明人對Eutypella sp.D-1采用了單菌多產物(OSMAC)策略，獲得了豐富的代謝產物，但沒有真正從基因層面對該菌進行探究。

為了更好的挖掘該菌株產結構獨特且活性多樣的次級代謝產物能力，可采用生物合成技術激發菌株的沉默基因，提高其產次級代謝物的能力。經基因組測序并進行生物信息學分析之后，發現該真菌的次級代謝產物生物合成基因簇在常規的實驗條件下往往表達很少，如果激活或改造微生物基因簇，可以充分發掘其產生次級代謝產物的潛力。

原生質體是指去除了細胞壁之后的細胞成分，隨著分子生物學技術的發展，其已成為研究真菌分子遺傳學的重要工具。對于真菌的遺傳轉化最常見的是原生質體介導的轉化方法。近年來，許多學者對真菌的原生質體的制備和轉化進行了大量的研究，閆思遠等通過構建枸杞內生輪狀鐮刀菌(Fusarium nematophilum)NQ8GⅡ4菌株原生質體，PEG介導外源DNA轉入原生質體，獲得GFP標記的轉化子，為闡明該菌與宿主植物相互作用的規律奠定基礎；農倩等通過構建裂殼菌L-14原生質體制備和再生體系，通過多因素實驗獲得最優制備方案，使再生率達到10.65％，為建立該菌株遺傳轉化體系奠定基礎。

真菌原生質體為球狀單細胞，其由于去除了細胞壁，更易攝取外源物質，使得能夠人為的有效靶向和改造基因，以揭示及研究基因的功能。在真菌次級代謝產物的研究中，可以通過原生質體轉化技術，靶向與次級代謝產物合成相關的基因，來揭示基因在相關代謝途徑中的具體作用。對于彎孢聚殼屬真菌原生質體的制備尚未有相關報道，為了進一步研究該屬真菌次級代謝產物合成機理，以挖掘其次級代謝產物合成能力，需要對彎孢聚殼屬真菌原生質體的制備與再生進行研究。

發明內容

本發明依托上述研究進行，提供了一種極地來源的彎孢聚殼屬真菌原生質體的制備方法。為了實現上述目的，本發明所采用的技術方案如下：

本發明的第一方面，提供了極地來源的彎孢聚殼屬真菌D-1(Eutypella sp.D-1)原生質體的制備方法，包括如下步驟：

(1)新鮮菌絲體制備：刮取固體平板上活化培養了2-3代的菌絲體或取菌株種子液接種至馬鈴薯葡萄糖水PDB液體培養基中搖瓶培養。

采用固體菌絲培養時，培養時間為3d；采用液體菌絲培養時，菌株種子液與馬鈴薯葡萄糖水PDB液體培養基的體積比為1:10，培養時間為1d。

(2)菌絲體收集：取步驟(1)中獲得的菌絲體于無菌離心管中，8000rpm離心10min棄上清后使用濃度為0.65～0.85mol/L的滅菌滲透壓穩定劑清洗2-3次，棄上清得到待用菌絲體。

由于缺失了細胞壁，原生質體需要適宜的滲透壓穩定劑來維持細胞形態，滲透壓過高或過低，會使原生質體皺縮或漲破，導致原生質體質量下降。