[發明專利]極地來源的彎孢聚殼屬真菌原生質體的制備方法

有效

• 申請號: 202110679651.8
• 申請日: 2021-06-18
• 公開（公告）號: CN113337406B
• 公開（公告）日: 2022-12-06
• 發明（設計）人: 盧小玲;寧耀東;胡波;于豪冰;劉小宇;孔杰;徐堯;焦炳華
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍海軍軍醫大學
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;C12R1/645
• 代理公司: 上海申浩律師事務所 31280
• 代理人: 趙青

1.極地來源的彎孢聚殼屬真菌Eutypella sp.D-1原生質體的制備方法，其特征在于，該真菌的保藏編號為CCTCC No:M2013144，制備方法包括如下步驟：

(1)新鮮菌絲體制備：刮取固體平板上活化培養了2-3代的菌絲體或取菌株種子液接種至馬鈴薯葡萄糖水PDB液體培養基中搖瓶培養；采用固體菌絲培養時，培養時間為3d；采用液體菌絲培養時，菌株種子液與馬鈴薯葡萄糖水PDB液體培養基的體積比為1:10，培養時間為1d；

(2)菌絲體收集：取步驟(1)中獲得的菌絲體于無菌離心管中，離心棄上清后使用濃度為0.7～0.75mol/L的滅菌滲透壓穩定劑NaCl溶液清洗2-3次，棄上清得到待用菌絲體；

(3)酶解液的制備：配置終濃度均為10-20mg/mL裂解酶和崩潰酶混合液，加入所述滅菌滲透壓穩定劑中充分溶解，微孔濾膜過濾除菌后，冷藏待用；

(4)原生質體制備：將步驟(3)所制備的酶解液加入到步驟(2)所收集的菌絲體中，充分混勻分散后，于120rpm搖床下24-30℃恒溫培養4-6h；

(5)原生質體收集：將步驟(4)的混合液用四層滅菌擦鏡紙進行過濾進行過濾，離心棄上清后使用所述滅菌滲透壓穩定劑清洗，并使用滲透壓穩定劑重懸原生質體；

(6)原生質體再生：將步驟(5)制備好的原生質體懸液與再生培養基混合，倒平板凝固后于28℃培養箱中培養，觀察復蘇情況。

2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于：

其中，步驟(2)中，離心條件為8000rpm離心10min。

3.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于：

其中，所述滅菌滲透壓穩定劑為NaCl溶液，經115℃、30min滅菌后制得。

4.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于：

其中，所述滲透壓穩定劑的濃度為0.75mol/L。

5.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于：

其中，步驟(3)中，所述酶解液的具體制備方法如下：按體積比為1:1、2:1或1:2稱取復合酶液于滲透壓穩定劑中，而后置于水平搖床120rpm充分溶解，再經0.22μm微孔濾膜過濾后使用。

6.根據權利要求5所述的制備方法，其特征在于：

其中，所述復合酶液中，裂解酶及崩潰酶的終濃度均為20mg/mL。

7.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于：

其中，步驟(5)中，混合液用四層滅菌擦鏡紙進行過濾后，2500rpm離心10min，棄上清后使用滅菌NaCl滲透壓穩定劑清洗2次，并采用該滲透壓穩定劑重懸原生質體。

8.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于：

其中，步驟(6)中，將制備好的原生質體懸液與冷卻到50℃的再生培養基混合，倒平板凝固后于28℃培養箱中培養3d，觀察復蘇情況，

所述再生培養基的組成如下：蔗糖200g/L、酵母3.5g/L、胰蛋白胨5g/L、瓊脂15g/L。

9.采用權利要求1～8任一項所述的制備方法制備得到的彎孢聚殼屬真菌Eutypellasp.D-1原生質體。