[發明專利]一種肝微粒體離體代謝氯化石蠟的方法

有效

• 申請號: 202110679003.2
• 申請日: 2021-06-18
• 公開（公告）號: CN113533556B
• 公開（公告）日: 2022-04-29
• 發明（設計）人: 黃曉梅;王旭;殷秋妙;丁晨紅;王威利;蘇秋權;王英;崔澤鋒
• 申請（專利權）人: 廣東省農業科學院農業質量標準與監測技術研究所
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/04
• 代理公司: 廣州知友專利商標代理有限公司 44104
• 代理人: 宣國華

本發明公開一種肝微粒體離體代謝氯化石蠟的方法，包括以下步驟：(1)將氯化石蠟溶于有機溶劑，得到氯化石蠟溶液，并向其中加入血清，靜置平衡后得到底物體系；(2)向底物體系先后加入磷酸鉀緩沖溶液、肝微粒體和NADPH酶再生體系，搖勻后得到最終反應體系，然后置于37℃水浴中振蕩反應；(3)向步驟(2)的反應體系加入冰冷的有機溶劑終止反應，然后進行離心，取上層清液，測定氯化石蠟含量。本發明采用血清作為氯化石蠟的載體，促進氯化石蠟與肝微粒體反應，顯著提高氯化石蠟的代謝清除率，實現肝微粒體離體代謝氯化石蠟的代謝清除率的測定。

技術領域

本發明涉及一種肝微粒體離體代謝氯化石蠟的方法。

背景技術

氯化石蠟(CPs)是一類氯代烷烴類混合物，主要應用于金屬加工業和塑料工業。它是我國產地環境和農產品污染最嚴重的鹵代有機污染物之一。根據碳鏈長度，氯化石蠟可分為短鏈氯化石蠟(SCCPs，C_10-13)、中鏈氯化石蠟(MCCPs，C_14-17)和長鏈氯化石蠟(LCCPs，C_18-20)。研究顯示，氯化石蠟對動物具有生殖毒性和發育毒性。

現有技術中，通過動物肝微粒體離體代謝鹵代有機污染物是研究其在動物體內代謝轉化機制的重要手段，后者是評價其生物毒性大小的重要因素。但目前尚無肝微粒體離體代謝氯化石蠟的報道?，F時肝微粒體離體代謝鹵代有機污染物的方法包括以下步驟：采用DMSO溶解鹵代有機污染物；在反應體系中加入磷酸鉀緩沖溶液、肝微粒體、鹵代有機污染物的DMSO溶液；將反應體系置于37℃水浴鍋預孵化5min后，加入NADPH酶再生體系，反應開始計時；然后加入冷甲醇終止反應，再加入有機溶劑萃取三次，合并萃取液，氮吹干后，加入初始流動相復溶，上機檢測鹵代有機污染物。值得注意的是，由于DMSO對酶具有一定的毒性，反應體系中DMSO的體積不得超過最終反應體系的1％。所以，由于底物溶液體積在最終反應系統中所占比例如此之小，為了準確量取底物溶液，并且考慮盡可能的節約反應原料，現有技術中最終反應體系通常設置為1mL。

氯化石蠟在動物體內代謝清除規律的研究是探討其生物富集性的關鍵因素，后者是氯化石蠟對生態/健康風險評估的重要因素。測定鹵代有機污染物的肝微粒體離體代謝清除率是模擬其在動物體內代謝清除規律的常用方法。但是采用現時的肝微粒體離體代謝鹵代有機污染物的方法對氯化石蠟進行實驗，難以測定其代謝清除率。這是由于現時檢測氯化石蠟濃度的方法的靈敏度相對較低，需要采用較高濃度的氯化石蠟作為底物進行實驗才能滿足后續檢測的需求；但由于肝微粒體代謝能力有限，其對底物的代謝清除率通常隨著底物濃度的增加而降低，在參考其他鹵代有機污染物的肝微粒體代謝條件時，即使采用能夠滿足氯化石蠟后續檢測方法的最低濃度0.2μg/mL，也很難觀察到氯化石蠟的消耗。

發明內容

本發明的目的是提供一種肝微粒體離體代謝氯化石蠟的方法，實現肝微粒體離體代謝氯化石蠟的代謝清除率的測定。

為了實現上述目的，本發明采用以下技術方案：

一種肝微粒體離體代謝氯化石蠟的方法，包括以下步驟：

(1)將氯化石蠟溶于有機溶劑，得到氯化石蠟溶液，并向其中加入血清，靜置平衡后得到底物體系；

(2)向底物體系先后加入磷酸鉀緩沖溶液、肝微粒體和NADPH酶再生體系，搖勻后得到最終反應體系，然后置于37℃水浴中振蕩反應；

(3)向步驟(2)的反應體系加入冰冷的有機溶劑終止反應，然后進行離心，取上層清液，測定氯化石蠟含量。

本發明向氯化石蠟溶液加入血清，并靜置平衡，使得高度疏水的氯化石蠟與血清有效結合，在后續反應中血清作為氯化石蠟的載體，促進氯化石蠟與肝微粒體蛋白酶反應，提高氯化石蠟的代謝清除率。

所述步驟(1)血清加入的體積為氯化石蠟溶液的1～10倍。