[發(fā)明專利]褪黑激素對子代獺兔毛囊細(xì)胞凋亡率影響的研究方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110678289.2
• 申請日: 2021-06-18
• 公開（公告）號: CN113413382A
• 公開（公告）日: 2021-09-21
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 封洋;馬占儒;楊瑞鑫;張帆
• 申請（專利權(quán)）人: 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: A61K31/4045
• 分類號: A61K31/4045;A61P17/00;A01K67/027;G01N1/06;G01N1/28;G01N1/30;G01N1/36;G01N1/44;G01N21/64
• 代理公司: 合肥律通專利代理事務(wù)所(普通合伙) 34140
• 代理人: 鄭松林

1.褪黑激素對子代獺兔毛囊細(xì)胞凋亡率影響的研究方法，其特征在于，包括如下研究步驟：

1)確定褪黑激素埋植劑量；

2)將實(shí)驗用兔分為激素埋植組以及不埋植激素的對照組，以在實(shí)驗用兔產(chǎn)子后，采集子代皮膚組織樣本；

3)制作皮膚組織樣本的切片；

4)切片的綜合處理，以及對細(xì)胞凋亡數(shù)據(jù)的測定。

所述步驟2)中激素埋植組埋植褪黑激素緩釋顆粒，不埋植激素的對照組埋植不含激素的硅膠顆粒；

所述步驟3)中切片的制作包括脫水、透明、包埋、切片、攤片和烤片；

所述步驟4)中切片的綜合處理包括蛋白酶K修復(fù)、破膜、室溫平衡、加反應(yīng)液、DAPI復(fù)染細(xì)胞核、封片以及鏡檢拍照。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的褪黑激素對子代獺兔毛囊細(xì)胞凋亡率影響的研究方法，其特征在于：所述步驟1)中褪黑激素的埋植劑量為10mg。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的褪黑激素對子代獺兔毛囊細(xì)胞凋亡率影響的研究方法，其特征在于：

所述步驟2)中實(shí)驗用兔為若干母兔與同一只公兔精液進(jìn)行人工授精，且在人工授精后診斷出受孕的孕兔作為實(shí)驗用兔；

所述步驟2)中實(shí)驗用兔產(chǎn)子后，自激素埋植組以及不埋植激素的對照組中選擇數(shù)量相一致的窩仔兔，采用頸部移位法進(jìn)行屠宰，屠宰后立即剝皮，于臀十字部位取2cm邊長的方形皮膚塊，用生理鹽水沖洗后立即放入多聚甲醛溶液中固定。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的褪黑激素對子代獺兔毛囊細(xì)胞凋亡率影響的研究方法，其特征在于：所述步驟3)中皮膚組織樣本的脫水為梯度脫水；

梯度脫水的具體步驟如下：

1)75％乙醇內(nèi)脫水1小時；

2)85％乙醇內(nèi)脫水1小時；

3)將95％乙醇分為兩組，各組內(nèi)脫水1小時；

4)將100％乙醇分為兩組，各組內(nèi)脫水45分鐘；

5)苯乙醇內(nèi)脫水45分鐘，其中苯乙醇溶液為體積比為1:1的二甲苯和乙醇；

所述步驟3)中皮膚組織樣本的透明由二甲苯作用，步驟3)中皮膚組織樣本的包埋由石蠟固定；

透明和包埋的具體步驟如下：

1)將二甲苯分為兩份，皮膚組織樣本置于每份二甲苯內(nèi)7分鐘；

2)其后將皮膚組織樣本置于苯蠟中1小時；

3)將石蠟分為兩份，皮膚組織樣本置于每份石蠟內(nèi)1小時；

所述步驟3)中皮膚組織樣本的切片步驟如下：

石蠟包埋48小時后切片，將蠟塊放在切片機(jī)上，先按住調(diào)平按鈕調(diào)節(jié)刀片和蠟塊的間隔以及視點(diǎn)，試切，切片機(jī)檔位先調(diào)到10微米,當(dāng)切到組織時調(diào)至6微米；

所述步驟3)中皮膚組織樣本的攤片和烤片步驟如下：

1)切下的組織輕輕放入攤片機(jī)中，待皮膚組織徹底展平后，用載玻片將組織撈出；

2)去除剩余的水后放置于烘片機(jī)上，進(jìn)行烘干處理。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的褪黑激素對子代獺兔毛囊細(xì)胞凋亡率影響的研究方法，其特征在于：

所述步驟4)中蛋白酶K修復(fù)的操作步驟下：

1)切片完全甩干前，用組化筆在組織周圍畫圈，在圈內(nèi)滴加蛋白酶K工作液覆蓋組織，37℃溫箱孵育22分鐘；

2)將玻片置于pH為7.4的PBS中后在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5分鐘；

所述蛋白酶K工作液濃度為原液：PBS＝1：9。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的褪黑激素對子代獺兔毛囊細(xì)胞凋亡率影響的研究方法，其特征在于：

所述步驟4)中破膜的操作步驟如下：

1)切片完全甩干前，在圈內(nèi)滴加破膜工作液覆蓋組織，常溫下孵育20分鐘；

2)將玻片置于PBS中后脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5分鐘；

所述破膜液為0.1％Triton，即Triton原液：PBS＝1:1000的混合溶液；

所述室溫平衡是將未完全甩干的切片，在圈內(nèi)滴加緩沖液覆蓋組織，緩沖液常溫孵育10分鐘。