[發明專利]一種活性和立體選擇性提高的烯鍵還原酶突變體及其編碼基因以及應用

有效

• 申請號: 202110674324.3
• 申請日: 2021-06-17
• 公開（公告）號: CN113481175B
• 公開（公告）日: 2023-07-14
• 發明（設計）人: 林金萍;魏東芝;張寶琪;杜涵
• 申請（專利權）人: 華東理工大學
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N1/21;C12P41/00;C12P7/24;C12R1/19
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司 31002
• 代理人: 余永莉

本發明公開了一種活性和立體選擇性提高的烯鍵還原酶突變體及其編碼基因以及應用，該烯鍵還原酶突變體包括以SEQ?ID?NO.1所示野生型的烯鍵還原酶OYE2p為模板，第84位氨基酸殘基發生突變形成的烯鍵還原酶突變體Y84A，Y84V，Y84L，Y84I，Y84T，Y84C，氨基酸序列如SEQ?ID?NO.3～8所示。根據本發明提供的烯鍵還原酶的突變體可高活性、高立體選擇性催化檸檬醛制備(R)?香茅醛，具有經濟環保、手性選擇性高的特點，為(R)?香茅醛的工業化生產提供一個潛在的生物催化劑。

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，更具體地涉及一種活性和立體選擇性提高的烯鍵還原酶突變體及其編碼基因以及應用。

背景技術

(R)-香茅醛((R)-(+)-Citronellal)，化學名為(3R)-3,7-二甲基-6-辛烯醛，化學結構式如(I)，是一種重要的香料及醫藥中間體，其可用于食品、日用品等調香，還可作為合成L-薄荷醇和維生素E的原料。目前，(R)-香茅醛主要由天然精油分離提取獲得，也可由檸檬醛經金屬催化劑催化加氫制得。

利用烯鍵還原酶催化檸檬醛不對稱還原合成(R)-香茅醛與其它方法相比具有環境友好、反應條件溫和、產物立體選擇性高等優點。目前已報道的能夠催化檸檬醛生成(R)-香茅醛的烯鍵還原酶極少，且催化活力普片偏低。Stewart等人獲得一株源自Pichiastipitis的烯鍵還原酶OYE2.6，其可以在5.75h內催化150mM?E-檸檬醛生成(R)-香茅醛，產物ee值達到98％【Chemical?Communications,2010,46(45):8558-8560.】；但底物E-檸檬醛需由檸檬醛(E，Z-檸檬醛的混合物)分離獲得。Hauer等人通過蛋白質工程手段對源自Zymomonas?mobilis的烯鍵還原酶NCR進行改造，最終突變株W66A對E-檸檬醛的對映體選擇性由99％(S)反轉為46％(R)，但對Z-檸檬醛的對映體選擇性仍僅為88％(S)，因此難以滿足生產(R)-香茅醛的需要。因此，開發能夠高活性、高選擇性催化檸檬醛生成(R)-香茅醛的烯鍵還原酶具有重要的工業應用價值。

發明內容

本發明的目的在于提供一種活性和立體選擇性提高的烯鍵還原酶突變體及其編碼基因以及應用，從而解決現有烯鍵還原酶催化合成(R)-香茅醛的技術存在立體催化活性偏低以及立體選擇性不高的問題。

為了解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案：

根據本發明的第一方面，提供一種活性和立體選擇性均提高的烯鍵還原酶突變體，包括以烯鍵還原酶突變體OYE2p作為模板，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示，將第84位氨基酸發生如下突變后的烯鍵還原酶突變體：第84位的酪氨酸Y突變為丙氨酸A的烯鍵還原酶突變體Y84A(SEQ?ID?NO.3)；第84位的酪氨酸Y突變為纈氨酸V的烯鍵還原酶突變體Y84V(SEQ?ID?NO.4)；第84位的酪氨酸Y突變為亮氨酸L的烯鍵還原酶突變體Y84L(SEQ?ID?NO.5)；第84位的酪氨酸Y突變為異亮氨酸I的烯鍵還原酶突變體Y84I(SEQ?ID?NO.6)；第84位的酪氨酸Y突變為蘇氨酸T的烯鍵還原酶突變體Y84T(SEQ?IDNO.7)；第84位的酪氨酸Y突變為半胱氨酸C的烯鍵還原酶突變體Y84C(SEQ?ID?NO.8)。

本發明以實驗室前期構建保藏的烯鍵還原酶OYE2p(來源于Saccharomycescerevisiae?YJM1341，參見文獻Bioresour.Bioprocess.(2018)5:9)作為模板，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示，對其進行定點突變，從而得到在催化活力和立體選擇性等方面顯著改善的烯鍵還原酶突變體。

根據本發明的第二方面，提供一種如上所述的酶活及立體選擇性提高的烯鍵還原酶突變體的編碼基因，所述編碼基因編碼如上面所述烯鍵還原酶突變體所示的氨基酸序列。