[發明專利]一種高效液相色譜串聯質譜檢測全血中免疫抑制劑的檢測試劑盒及其檢測方法

有效

• 申請號: 202110673324.1
• 申請日: 2021-06-17
• 公開（公告）號: CN113533555B
• 公開（公告）日: 2022-04-26
• 發明（設計）人: 曾珊珊;張琦;韓寶玉;劉華芬
• 申請（專利權）人: 杭州凱萊譜精準醫療檢測技術有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/72
• 代理公司: 杭州天昊專利代理事務所(特殊普通合伙) 33283
• 代理人: 向慶寧;曹小燕

本發明提供一種高效液相色譜串聯質譜檢測全血中免疫抑制劑的檢測試劑盒及其檢測方法，通過在內標液中添加抗氧化劑維生素E，并與含有七水合硫酸鋅、純化水和甲醇的內標稀釋液混合，用于樣本前處理，既可發揮內標的作用，還可同步實現紅細胞處理、蛋白沉淀和目標物質提取，并使免疫抑制劑在溶液基質中更加穩定，從而提升檢測準確性和靈敏度；同時本發明還采用同位素標記的西羅莫司作為依維莫司的內標，用于代替同位素標記的依維莫司，克服了依維莫司對同位素標記依維莫司的干擾，滿足檢測要求，可同時檢測四種免疫抑制劑，降低內標成本，檢測成本更低，檢測結果更加準確和穩定。

技術領域

本發明屬于生物化學分析技術領域，具體而言，涉及一種高效液相色譜串聯質譜檢測全血中免疫抑制劑的檢測試劑盒及其檢測方法。

背景技術

免疫抑制劑是一類可抑制機體異常反應的藥物，能夠抑制與免疫反應有關細胞(T細胞和B細胞等巨噬細胞)的增殖和功能，降低免疫應答。在臨床上主要用于防止器官移植時的排斥反應以及自身免疫性疾病的治療，如風濕性關節炎、紅斑狼瘡、皮膚真菌病、炎性腸病和自身免疫性溶血貧血等。隨著人類對免疫應答規律認識的不斷深入，一些高效低毒的新型免疫抑制劑如環孢霉素A、他克莫司、西羅莫司和依維莫司等，得到了開發和應用。免疫抑制劑的藥代動力學存在明顯的個體內及個體之間的差異，且治療濃度與中毒濃度接近，血藥濃度稍高出現毒副作用，稍低則出現排斥反應，治療窗很窄。由于藥物的療效和毒副作用均與用藥劑量密切相關，可通過體內藥物濃度的監測，合理地指導臨床調整用藥劑量，確保藥物濃度處于安全有效的治療范圍。

免疫抑制劑可以單獨使用，也可聯合使用以增強藥物療效或減輕藥物毒副作用。從作用機理上來看，環孢霉素A和他克莫司屬于鈣神經蛋白抑制劑，主要通過抑制T細胞活化而發揮免疫抑制作用。環孢霉素A是由11個氨基酸構成的環肽，具有較強的親脂性，血液中約50％的環孢霉素A被紅細胞攝取，30％結合在血漿脂蛋白和其他蛋白上，可使用全血或血漿對其進行血藥濃度的監測。他克莫司是從鏈霉菌的代謝產物中分離得到大環內酯類化合物，體外實驗證實其免疫活性是環孢霉素A的50-100倍。他克莫司主要經胃腸道吸收，在血中絕大部分分布于紅細胞，臨床上使用全血血藥濃度的監測來調整其最佳用藥劑量。西羅莫司及其衍生物依維莫司是三烯大環內酯類化合物，為哺乳動物西羅莫司靶蛋白抑制劑，用藥后廣泛分布于各組織，在血液中主要與紅細胞結合，因此臨床上也采用全血樣本進行藥物濃度監測。

目前國內外有關全血中免疫抑制劑的測定方法報道很多，常見的方法有：免疫分析、液相色譜法，在眾多的方法中，液相串聯質譜法為測定免疫抑制劑的首選方法。但是以往方法普遍存在操作過程復雜、干擾因素多、特異性差、分析時間長、檢測通量低的問題，這主要都是因為樣品前處理過程繁瑣、穩定性差所造成的。

現有的免疫抑制劑樣品前處理方法主要有蛋白沉淀、液液萃取等，如CN109187839A，采用硫酸鋅和甲醇溶液作為蛋白沉淀劑對全血樣本進行前處理，從而進行樣本中他克莫司、西羅莫司、依維莫司和環孢霉素A四種免疫抑制劑的檢測，但由于其樣本前處理過程存在穩定性差的問題，導致檢測結果容易受干擾，誤差大，檢測靈敏度不高。

因此迫切需要一種操作簡單、處理效率高、檢測通量高、檢測準確度和靈敏度高、成本低、人工工作量小等優點的免疫抑制劑樣品前處理方法，使其可以克服現有方法的以上不足和缺陷。

發明內容

為解決上述問題，本發明提供一種改進的高效液相色譜串聯質譜同時檢測全血中4種免疫抑制劑的檢測試劑盒及其檢測方法，通過在內標液中添加抗氧化劑維生素E，并與含有七水合硫酸鋅、純化水和甲醇的內標稀釋液混合，用于樣本前處理，一步操作實現紅細胞處理、蛋白沉淀和內標添加，并使免疫抑制劑在溶液基質中更加穩定，從而提升檢測準確性和靈敏度；同時本發明還采用同位素標記的西羅莫司作為依維莫司的內標，用于代替同位素標記的依維莫司，克服了依維莫司對同位素標記依維莫司的干擾，滿足檢測要求，降低內標成本，檢測成本更低，檢測結果更加準確和穩定。