[發(fā)明專利]一種A型塞內(nèi)卡病毒SVA/HeB全長感染性cDNA克隆及其制備方法與應(yīng)用

有效

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• 申請日: 2021-06-17
• 公開（公告）號: CN113308480B
• 公開（公告）日: 2022-07-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 袁萬哲;郭笑然;趙款;雷白時;張武超;劉小娜
• 申請（專利權(quán)）人: 河北農(nóng)業(yè)大學
• 主分類號: C12N15/41
• 分類號: C12N15/41;C12N15/63;C12N7/01;C12N15/11
• 代理公司: 北京科億知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11350
• 代理人: 李興林

本發(fā)明公開了一種A型塞內(nèi)卡病毒SVA/HeB全長感染性cDNA克隆及其制備方法與應(yīng)用，屬于病毒技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明所用拯救系統(tǒng)在A型塞內(nèi)卡病毒5’端上游引入CMV增強子、β?actin啟動子和核酶序列；在3’端下游引入核酶和終止子序列，通過RT?RCR方法分段擴增SVA全長基因組片段，利用同源重組技術(shù)克隆至pOK12載體，構(gòu)建含SVA/HeB全長cDNA的重組質(zhì)粒。基于感染性cDNA克隆拯救得到的病毒為深入研究SVA的生物學特性、復(fù)制機制、致病機理及相關(guān)疫苗的研發(fā)奠定了基礎(chǔ)，具有重要的科學應(yīng)用價值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于病毒技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種A型塞內(nèi)卡病毒SVA/HeB全長感染性cDNA克隆及其制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)

A型塞內(nèi)卡病毒(SenecavirusA，SVA)屬于小核糖核酸病毒科塞內(nèi)卡病毒屬成員，為無囊膜的單股正鏈RNA病毒。現(xiàn)已證實SVA感染豬能夠引發(fā)原發(fā)性水泡病，引起豬的鼻吻、蹄部冠狀帶的水泡病變，同時伴有跛行、厭食、嗜睡和發(fā)燒等臨床表現(xiàn)。與口蹄疫、豬水泡病和水泡性口炎引起的臨床癥狀難以區(qū)分。

2002年，美國科學家首次在細胞培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)SVA。2015年以后，在加拿大、美國、巴西、泰國、中國等多個國家爆發(fā)了SVA疫情。通過回顧性監(jiān)測和流行病學調(diào)查發(fā)現(xiàn)，SVA在我國多個地區(qū)流行和傳播，并且流行范圍越來越廣。但是到目前為止對SVA的致病機制以及相關(guān)疫苗的研究甚少，而SVA反向遺傳操作平臺是研究SVA致病機制以及相關(guān)疫苗的關(guān)鍵工具。

SVA感染性克隆的構(gòu)建大多基于傳統(tǒng)的酶切將片段與載體連接，其主要包括兩種方法：一種是PCR引物設(shè)計時引入載體上的酶切位點，PCR產(chǎn)物經(jīng)雙酶切后定向克隆到目的載體上；另一種是TA載體連接。這兩種方法費時費力，過程繁冗。而同源重組技術(shù)是一種新的、快速、簡潔的克隆方法，旨在克服上述缺陷，它可以在質(zhì)粒的任何位點進行一個或多個目標DNA片段的插入，而不需要任何限制性內(nèi)切酶和連接酶，并且克隆效率高，陽性克隆高達90％以上。

另外全長的cDNA合成以后可以利用兩種方法來構(gòu)建能夠產(chǎn)生子代病毒的策略：RNA轉(zhuǎn)染和DNA轉(zhuǎn)染。在RNA轉(zhuǎn)染策略中，病毒的RNA是在體外轉(zhuǎn)錄合成的，其使用的是T7或者SP6原核啟動子，體外轉(zhuǎn)錄出病毒的RNA，然后轉(zhuǎn)染到細胞中啟動病毒的拯救過程，但此方法操作繁瑣、不穩(wěn)定且試劑昂貴。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種A型塞內(nèi)卡病毒SVA/HeB全長感染性cDNA克隆及其制備方法與應(yīng)用。

本發(fā)明使用的DNA轉(zhuǎn)染策略，首次采用真核雙啟動子CMV增強子和β－acitn啟動子作為全長病毒基因組cDNA感染性克隆的上游，將完整的質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)染細胞便可以得到感染性的病毒粒子，與其他專利中感染性克隆所使用的啟動子相比，本發(fā)明所采用的構(gòu)建策略具有更高的啟動效率，拯救更快速便捷。

為達上述目的，本發(fā)明采用如下的技術(shù)方案：

一種A型塞內(nèi)卡病毒SVA/HeB全長感染性cDNA克隆，其拯救系統(tǒng)是在塞內(nèi)卡病毒核酸序列的5’端上游插入CMV增強子、β-actin啟動子和核酶序列；在塞內(nèi)卡病毒核酸序列的3’端下游插入核酶和終止子序列。

本發(fā)明所用重組質(zhì)粒的骨架載體為改造后的pOK-CMV-Actin。

在本發(fā)明中，將所述塞內(nèi)卡病毒的核苷酸序列通過EcoR I酶切位點以同源重組方式插入pOK-CMV-Actin載體中。所述插入的塞內(nèi)卡病毒的核苷酸序列如SEQ ID NO.7示。