[發明專利]一種A型塞內卡病毒SVA/HeB全長感染性cDNA克隆及其制備方法與應用

有效

• 申請號: 202110673091.5
• 申請日: 2021-06-17
• 公開（公告）號: CN113308480B
• 公開（公告）日: 2022-07-29
• 發明（設計）人: 袁萬哲;郭笑然;趙款;雷白時;張武超;劉小娜
• 申請（專利權）人: 河北農業大學
• 主分類號: C12N15/41
• 分類號: C12N15/41;C12N15/63;C12N7/01;C12N15/11
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 李興林

1.一種A型塞內卡病毒SVA/HeB全長感染性cDNA克隆的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）載體的改造：選用低拷貝載體pOK12作為A型塞內卡全長感染性cDNA克隆構建的載體，CMV增強子和β-actin啟動子序列通過Sal I和Hind III 克隆至 pOK12 載體的相應酶切位點中，構建含雙啟動子的低拷貝質粒pOK-CMV-Actin；

（2）以A型塞內卡病毒SVA/HeB的cDNA為模板，分別設計、合成覆蓋SVA/ HeB病毒全基因組的三對重疊引物AF/AR、BF/BR和CF/CR；

所述AF的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述AR的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，用引物AF/AR擴增，獲得第一個基因片段A片段；所述BF的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述BR的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，用引物BF/BR擴增獲得第二個基因片段B片段；所述CF的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述CR的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，用引物CF/CR擴增獲得第三個基因片段C片段；

（3）將pOK-CMV-Actin利用EcoR I線性化，將SVA基因組的A、B和C片段通過同源重組克隆至pOK-CMV-Actin載體中，即獲得重組質粒pOK-rSVA/HeB。