[發(fā)明專利]一種生物法生產(chǎn)L-5-甲基四氫葉酸的方法

有效

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• 申請日: 2021-06-17
• 公開（公告）號: CN113403355B
• 公開（公告）日: 2022-05-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王書寧;王煜博;張萌;梁繼禹;伊繼洪;許平
• 申請（專利權(quán)）人: 山東大學(xué)
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12N15/67;C12P17/18;C12R1/19
• 代理公司: 濟(jì)南圣達(dá)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37221
• 代理人: 李健康

1.一種生物法生產(chǎn)L-5-甲基四氫葉酸的方法，步驟是：

（1）構(gòu)建產(chǎn)L-5-甲基四氫葉酸（L-5-MTHF）的工程菌：

a. 以大腸桿菌E. coli BL21(DE3)基因組為模板擴(kuò)增SEQ ID NO.3所示的二氫葉酸還原酶基因folA以及SEQ ID NO.4所示的亞甲基四氫葉酸還原酶基因metF，將folA基因和metF基因克隆到pACYCDuet-1載體的兩個(gè)多克隆位點(diǎn)上，構(gòu)建重組質(zhì)粒，命名為pACYCDuet-metF-folA；以自產(chǎn)乙醇梭菌（C. autoethanogenum）基因組為模板擴(kuò)增SEQ ID NO.5所示的甲酸四氫葉酸連接酶、甲酰四氫葉酸環(huán)水解酶和亞甲基四氫葉酸脫氫酶基因fhs-fchA-folD，將fhs-fchA-folD基因克隆到pETDuet-1載體的多克隆位點(diǎn)上，構(gòu)建重組載體，命名為pETDuet-WL；以扭脫甲基桿菌（M. extorquens）AM1基因組作為模板擴(kuò)增SEQ ID NO.6所示的甲酸四氫葉酸連接酶基因ftfL以及SEQ ID NO.7所示的甲酰四氫葉酸環(huán)水解酶和亞甲基四氫葉酸脫氫酶基因fchA-mtdA，將ftfL、fchA和mtdA克隆到pETDuet-1載體的多克隆位點(diǎn)上，構(gòu)建重組載體，命名為pETDuet-C1T；

b. 將質(zhì)粒pACYCDuet-metF-folA和pETDuet-WL共同轉(zhuǎn)化到E. coli BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，在含氯霉素和氨芐青霉素抗性的LB固體平板上培養(yǎng)，陽性菌落菌株即為產(chǎn)L-5-MTHF的工程菌，命名為BL21-WL；將質(zhì)粒pACYCDuet-metF-folA和pETDuet-C1T共同轉(zhuǎn)化到敲除甲硫氨酸合成酶基因（metH）的E. coli BL21(ΔmetH)感受態(tài)細(xì)胞中，在含氯霉素和氨芐青霉素抗性的LB固體平板上培養(yǎng)，陽性菌落菌株即為產(chǎn)L-5-MTHF的工程菌，命名為BL21(ΔmetH)-C1T；

（2）產(chǎn)L-5-MTHF的工程菌發(fā)酵：

將產(chǎn)L-5-MTHF的工程菌BL21-WL菌株或BL21(ΔmetH)-C1T菌株以體積比1~5%的接種量接種到含有氨芐青霉素和氯霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37±1℃和180~220 rpm轉(zhuǎn)速條件下培養(yǎng)2~4小時(shí)至OD600nm為0.6~1.0，獲得菌液；向制得的菌液中加入終濃度為0.4~0.8 mM 的IPTG，在20~37℃、100~120 rpm轉(zhuǎn)速下誘導(dǎo)8~16小時(shí)，然后將培養(yǎng)液離心收集菌體，即獲得含L-5-MTHF的工程菌細(xì)胞；

其中，上述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方及組分終濃度是：胰蛋白胨 10~15 g?L-1，酵母粉 20~30g?L-1，甘油 2~5 ml?L-1，葉酸 0.01~0.4 g?L-1，甲酸鈉 0.1~4.0 g?L-1，KH2PO4 2~4 g?L-1，K2HPO4 12~14 g?L-1；氨芐青霉素終濃度為50 μg?ml-1，氯霉素的終濃度為25 μg?ml-1；

（3）破碎工程菌細(xì)胞，釋放出L-5-MTHF：

將離心后獲得的工程菌細(xì)胞在厭氧箱中用含0.1%的抗壞血酸和含0.1%巰基乙醇的50mM pH 7.2 的經(jīng)煮沸后脫氣厭氧處理的Tris-HCl溶液重懸，密封在厭氧小瓶中，100℃水浴煮沸10 min破碎細(xì)胞，即得含L-5-MTHF的細(xì)胞破碎液，立即將其冰浴，并于15,000 rpm，4℃離心15 min后收集上清，再加入新鮮小鼠血清至100 μl?ml-1，37℃反應(yīng)3 h，煮沸5 min終止反應(yīng)，離心取上清，用0.22 μm的醋酸纖維素濾膜過濾，濾液裝入液相小瓶；

（4）使用201×7強(qiáng)堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂純化L-5-MTHF，并使用高效液相色譜（HPLC）對L-5-MTHF產(chǎn)量進(jìn)行測定：

其中L-5-MTHF的純化方法是：用1 M的NaOH和1 M的HCl處理強(qiáng)堿性苯乙烯系陰離子交換樹脂2次，超純水洗至中性，再用1 M的NaOH浸泡樹脂24 h，將其轉(zhuǎn)變?yōu)镺H型，用超純水洗至中性，用50 mM pH 7.2的Tris-HCl緩沖液平衡柱子至流出液與緩沖液pH值相同，將步驟（3）液相小瓶中的濾液樣品在避光條件下上樣，用0.1 M pH 7.2的NaCl洗脫，紫外檢測器在290 nm下檢測并收集洗脫液；

其中HPLC對L-5-MTHF測定的方法是：熒光檢測器Ex=290 nm, Em=356 nm，以體積比為93:7的33 mM pH 3.0磷酸鉀和乙腈為流動(dòng)相，上樣量20 μl，走樣時(shí)間30 min，柱溫箱溫度為30℃，保留時(shí)間為19.3±0.1min。