[發(fā)明專利]一種生物法生產(chǎn)L-5-甲基四氫葉酸的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110672088.1
• 申請(qǐng)日: 2021-06-17
• 公開（公告）號(hào): CN113403355B
• 公開（公告）日: 2022-05-31
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王書寧;王煜博;張萌;梁繼禹;伊繼洪;許平
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/70;C12N15/67;C12P17/18;C12R1/19
• 代理公司: 濟(jì)南圣達(dá)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37221
• 代理人: 李健康

本發(fā)明公開了一種生物法生產(chǎn)L?5?甲基四氫葉酸(L?5?MTHF)的方法，是在大腸桿菌中敲除了分解代謝途徑中的甲硫氨酸合成酶基因(metH)，并引入了一條新的產(chǎn)L?5?MTHF的代謝途徑構(gòu)建了產(chǎn)L?5?MTHF的工程菌BL21?WL菌株或BL21(ΔmetH)?C1T菌株，通過(guò)對(duì)所構(gòu)建的工程菌產(chǎn)L?5?MTHF的發(fā)酵條件優(yōu)化，所述工程菌最大細(xì)胞干重產(chǎn)量可達(dá)445.94μg·g^?1，比優(yōu)化前提高了99.71％，達(dá)到出發(fā)菌株的10.0倍，換算為每升培養(yǎng)物的產(chǎn)量后可達(dá)1249.11μg，遠(yuǎn)大于目前報(bào)道中的以E.coli為宿主菌的L?5?MTHF產(chǎn)量(119.84μg·L^?1)。預(yù)示本發(fā)明方法及構(gòu)建的工程菌具有極大的應(yīng)用價(jià)值和市場(chǎng)前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)L-5-甲基四氫葉酸(L-5-MTHF)的方法，尤其涉及一種利用構(gòu)建大腸桿菌工程菌生物法生產(chǎn)L-5-MTHF的方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

L-5-甲基四氫葉酸(L-5-MTHF)，是維生素B9的生物活性形式，可直接被人體吸收參與體內(nèi)的甲基化過(guò)程和DNA合成，對(duì)許多疾病都有一定的治療作用，如巨紅細(xì)胞貧血癥、神經(jīng)管缺陷和癌癥等，在維持人體健康方面具有重要作用。作為葉酸類藥物中唯一可以透過(guò)血腦屏障的物質(zhì)，L-5-MTHF可以用來(lái)預(yù)防阿爾茲海默癥，另外，人體中亞甲基四氫葉酸還原酶基因突變會(huì)影響體內(nèi)L-5-MTHF的合成，也會(huì)引發(fā)人體的一系列疾病，因此，對(duì)于亞甲基四氫葉酸還原酶基因突變的人群來(lái)說(shuō)，直接服用L-5-MTHF類藥物是十分必要的。歐盟委員會(huì)于2014年3月19日決定將L-5-MTHF作為一種新型食品添加劑，增加了L-5-MTHF的市場(chǎng)需求量，這迫使需不斷的更新技術(shù)以獲得更大量的L-5-MTHF。

在已有的文獻(xiàn)報(bào)道中，大部分5-MTHF都是經(jīng)化學(xué)法合成的，以葉酸為原料，先還原為四氫葉酸，后經(jīng)甲基化和進(jìn)一步還原生成5-MTHF。但化學(xué)合成需要大量的強(qiáng)化學(xué)還原劑，具有一定的危險(xiǎn)性，且合成的5-MTHF是外消旋混合物，需要通過(guò)手性拆分獲得具有生物活性的L-5-MTHF。此外，化學(xué)法合成5-MTHF產(chǎn)率小，純度低，污染環(huán)境，不利于人體健康。

經(jīng)檢索，有關(guān)對(duì)Escherichia coli進(jìn)行代謝改造，在其細(xì)胞中構(gòu)建新的合成L-5-MTHF代謝途徑，且阻斷L-5-MTHF的分解代謝途徑，并進(jìn)一步通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵條件的生物法合成L-5-MTHF的方法還未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明要解決的問(wèn)題是提供一種利用大腸桿菌工程菌生物法生產(chǎn)L-5-甲基四氫葉酸(L-5-MTHF)的方法。

本發(fā)明所述的生物法生產(chǎn)L-5-MTHF的方法，步驟是：

(1)構(gòu)建產(chǎn)L-5-MTHF的工程菌：

a.以Escherichia.coli BL21(DE3)基因組為模板擴(kuò)增SEQ ID NO.3所示的二氫葉酸還原酶基因folA以及SEQ ID NO.4所示的亞甲基四氫葉酸還原酶基因metF，將folA基因和metF基因克隆到pACYCDuet-1載體的兩個(gè)多克隆位點(diǎn)上，構(gòu)建重組質(zhì)粒，命名為pACYCDuet-metF-folA；以Clostridium autoethanogenum基因組為模板擴(kuò)增SEQ ID NO.5所示的甲酸四氫葉酸連接酶、甲酰四氫葉酸環(huán)水解酶和亞甲基四氫葉酸脫氫酶基因fhs-fchA-folD，將fhs-fchA-folD基因克隆到pETDuet-1載體的多克隆位點(diǎn)上，構(gòu)建重組載體，命名為pETDuet-WL；以Methylobacterium extorquens AM1基因組作為模板擴(kuò)增SEQ IDNO.6所示的甲酸四氫葉酸連接酶基因ftfL以及SEQ ID NO.7所示的甲酰四氫葉酸環(huán)水解酶和亞甲基四氫葉酸脫氫酶基因fchA-mtdA，將ftfL、fchA和mtdA克隆到pETDuet-1載體的多克隆位點(diǎn)上，構(gòu)建重組載體，命名為pETDuet-C1T；