[發(fā)明專利]羽衣甘藍(lán)表皮蠟質(zhì)性狀的分子標(biāo)記及其區(qū)分方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110668596.2
• 申請(qǐng)日: 2021-06-16
• 公開（公告）號(hào): CN113215303B
• 公開（公告）日: 2022-02-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 祝朋芳;馮馨;張思萌;劉錚;周福慧;劉睿
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6895
• 分類號(hào): C12Q1/6895;C12Q1/6858;C12Q1/6809;C12N15/11
• 代理公司: 北京大地智谷知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11957
• 代理人: 武麗華

本發(fā)明涉及一種用于區(qū)分羽衣甘藍(lán)表皮蠟質(zhì)性狀的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記為酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列(CAPS)，所述酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列(CAPS)的原始序列的上游引物的核苷酸序列為SEQ ID NO：1，下游引物的核苷酸序列為SEQ ID NO：2，所述分子標(biāo)記區(qū)分羽衣甘藍(lán)表皮蠟質(zhì)性狀的應(yīng)用方法包括如下步驟：(1)提取羽衣甘藍(lán)基因組DNA；(2)所述分子標(biāo)記PCR擴(kuò)增；(3)限制性內(nèi)切酶NcoⅠ酶切PCR產(chǎn)物；(4)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。本發(fā)明建立了一種應(yīng)用CAPS分子標(biāo)記在羽衣甘藍(lán)任意發(fā)育時(shí)期區(qū)分表皮蠟質(zhì)性狀的方法，在羽衣甘藍(lán)表皮蠟質(zhì)鑒定與新品種選育方面具有重要的科學(xué)指導(dǎo)意義。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于植物分子領(lǐng)域，具體涉及一種羽衣甘藍(lán)表皮蠟質(zhì)性狀的分子標(biāo)記及其區(qū)分方法，可用于羽衣甘藍(lán)表皮蠟質(zhì)性狀分子標(biāo)記輔助選擇育種。

背景技術(shù)

羽衣甘藍(lán)(Brassica oleracea var.acephala)是十字花科蕓薹屬二年生觀葉花卉。具有色彩鮮艷、形態(tài)多樣、耐寒性強(qiáng)、觀賞期長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，是北方早春、晚秋及初冬的重要觀賞植物。蠟質(zhì)是一類親酯類化合物，附著于植物表面形成疏水層。植物葉片表皮蠟質(zhì)是抵抗各種生物和非生物脅迫的“物理屏障”。羽衣甘藍(lán)是觀葉植物，葉片表皮蠟質(zhì)含量的多少也影響葉片顏色呈現(xiàn)。

分子標(biāo)記輔助育種具有快速鑒定目標(biāo)性狀，省時(shí)價(jià)廉等特點(diǎn)。酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列CAPS標(biāo)記是一種結(jié)合PCR擴(kuò)增與限制性內(nèi)切酶酶切，檢測(cè)SNP位點(diǎn)多態(tài)性的分子標(biāo)記技術(shù)。CAPS分子標(biāo)記操作方法簡(jiǎn)便、價(jià)格低廉，主要應(yīng)用在植物基因分型、分子標(biāo)記輔助選擇育種、品種鑒定等方面。目前尚未見通過分子標(biāo)記區(qū)分羽衣甘藍(lán)蠟質(zhì)性狀的方法。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種用于羽衣甘藍(lán)表皮蠟質(zhì)性狀的分子標(biāo)記及其區(qū)分方法，能夠在羽衣甘藍(lán)任意發(fā)育階段區(qū)分其表皮蠟質(zhì)性狀，加快羽衣甘藍(lán)育種進(jìn)程。本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種用于區(qū)分羽衣甘藍(lán)表皮蠟質(zhì)性狀的分子標(biāo)記，所述分子標(biāo)記為酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列(CAPS)，所述酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列(CAPS)的原始序列的上游引物的核苷酸序列為SEQ ID NO：1，下游引物的核苷酸序列為SEQ ID NO：2。

另一方面，本申請(qǐng)還保護(hù)一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的分子標(biāo)記區(qū)分羽衣甘藍(lán)表皮蠟質(zhì)性狀的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)羽衣甘藍(lán)基因組DNA提取：

采用CTAB法，提取待測(cè)羽衣甘藍(lán)基因組DNA；

(2)PCR擴(kuò)增原始序列：

PCR反應(yīng)體系：包括2×Taq酶緩沖液5μL，DNA模板1μL，上游引物1μL，下游引物1μL，去離子水2μL；

PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5分鐘；94℃變性30秒，54℃退火30秒，72℃延伸30s秒，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸7分鐘；4℃保存；

(3)限制性內(nèi)切酶NcoⅠ酶切PCR產(chǎn)物：

限制性內(nèi)切酶NcoⅠ識(shí)別序列為C^CATGG；

酶切反應(yīng)體系：PCR產(chǎn)物3μL，NcoⅠ限制性內(nèi)切酶0.5μL，10×酶切緩沖液2μL，去離子水14.5μL；

酶切反應(yīng)條件：37℃酶切30分鐘；

(4)酶切后PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)：

經(jīng)凝膠成像儀成像后，當(dāng)顯示出254bp和137bp兩條特異性條帶時(shí)，為表皮蠟質(zhì)少的羽衣甘藍(lán)；當(dāng)顯示出391bp一條特異性條帶時(shí)，為表皮蠟質(zhì)多的羽衣甘藍(lán)。

進(jìn)一步地，所述方法在羽衣甘藍(lán)發(fā)育任意時(shí)期均可鑒定羽衣甘藍(lán)蠟質(zhì)性狀。

另一方面，本申請(qǐng)還保護(hù)一種用于區(qū)分羽衣甘藍(lán)表皮蠟質(zhì)性狀的分子標(biāo)記的獲取方法，其特征在于，包括以下步驟：