[發明專利]羽衣甘藍表皮蠟質性狀的分子標記及其區分方法

有效

• 申請號: 202110668596.2
• 申請日: 2021-06-16
• 公開（公告）號: CN113215303B
• 公開（公告）日: 2022-02-18
• 發明（設計）人: 祝朋芳;馮馨;張思萌;劉錚;周福慧;劉睿
• 申請（專利權）人: 沈陽農業大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6858;C12Q1/6809;C12N15/11
• 代理公司: 北京大地智谷知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11957
• 代理人: 武麗華

1.一種用于區分羽衣甘藍表皮蠟質性狀的分子標記，其特征在于，所述分子標記為酶切擴增多態性序列(CAPS)，所述酶切擴增多態性序列(CAPS)的原始序列的上游引物的核苷酸序列為SEQ ID NO：1，下游引物的核苷酸序列為SEQ ID NO：2。

2.一種根據權利要求1所述的分子標記區分羽衣甘藍表皮蠟質性狀的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)羽衣甘藍基因組DNA提取：

采用CTAB法，提取待測羽衣甘藍基因組DNA；

(2)PCR擴增原始序列：

PCR反應體系：包括2×Taq酶緩沖液5μL，DNA模板1μL，上游引物1μL，下游引物1μL，去離子水2μL；

PCR反應條件：94℃預變性5分鐘；94℃變性30秒，54℃退火30秒，72℃延伸30秒，35個循環；72℃延伸7分鐘；4℃保存；

(3)限制性內切酶NcoⅠ酶切PCR產物：

限制性內切酶NcoⅠ識別序列為C^CATGG；

酶切反應體系：PCR產物3μL，NcoⅠ限制性內切酶0.5μL，10×酶切緩沖液2μL，去離子水14.5μL；

酶切反應條件：37℃酶切30分鐘；

(4)酶切后PCR產物瓊脂糖凝膠電泳檢測：

經凝膠成像儀成像后，當顯示出254bp和137bp兩條特異性條帶時，為表皮蠟質少的羽衣甘藍；當顯示出391bp一條特異性條帶時，為表皮蠟質多的羽衣甘藍。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述Taq酶緩沖液含Taq酶0.2U、dNTPs1μM及鎂離子。

4.根據權利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述方法在羽衣甘藍發育任意時期均可鑒定羽衣甘藍蠟質性狀。

5.一種用于區分羽衣甘藍表皮蠟質性狀的分子標記的獲取方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)羽衣甘藍的培育：分別培育表皮蠟質多和蠟質少的羽衣甘藍；

(2)羽衣甘藍基因組DNA提取：

采用CTAB法，分別提取表皮蠟質多和蠟質少的羽衣甘藍基因組DNA；

(3)羽衣甘藍蠟質基因全長克隆引物設計：

全長克隆引物包括上游全長克隆引物和下游全長克隆引物，相應的核苷酸序列分別為SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4；

(4)PCR擴增：

PCR反應體系：包括2×高保真Taq酶緩沖液5μL，上游全長克隆引物1μL，下游全長克隆引物1μL，DNA模板1μL，去離子水2μL，總計10μL；

PCR反應條件：98℃預變性3分鐘；98℃變性10秒，54℃退火50秒，72℃延伸2分鐘，35個循環；72℃延伸7分鐘；4℃保存；

(5)瓊脂糖凝膠電泳：

將PCR產物用1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像儀觀察條帶位置；

(6)擴增產物回收；

(7)回收產物連接克隆載體，轉化大腸桿菌；

(8)測序：

測得葉表皮多蠟質羽衣甘藍的核苷酸序列為SEQ ID NO：5，葉表皮少蠟質羽衣甘藍的核苷酸序列為SEQ ID NO：6；

(9)合成用于區分羽衣甘藍葉表皮蠟質性狀的分子標記

根據步驟(8)中所得的核苷酸序列SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6，確定酶切位點為C^CATGG；設計合成所述酶切擴增多態性序列(CAPS)的原始序列的上游引物核苷酸序列SEQID NO：1和下游引物核苷酸序列SEQ ID NO：2。

6.根據權利要求5所述的用于區分羽衣甘藍表皮蠟質性狀的分子標記的獲取方法，其特征在于，所述高保真Taq酶緩沖液含高保真Taq酶0.2U、dNTPs 1μM及鎂離子。